引論：我們為您整理了1篇微生物論文范文，供您借鑒以豐富您的創作。它們是您寫作時的寶貴資源，期望它們能夠激發您的創作靈感，讓您的文章更具深度。
微生物論文:甘草有益微生物論文
【摘要】植物體內大量分布的微生物對植物產生的影響已成為人們關注的熱點，特別是那些有益的影響可對植物的生長及活性成分的形成產生一定的作用。甘草作為一種大宗中藥，其栽培品的質量一直是人們所關心的問題，甘草有益微生物對提高甘草的品質有重要作用。該文綜述了甘草有益微生物的研究進展，以期對提高栽培甘草的質量起到指導意義。
【關鍵詞】甘草;內生菌;根瘤菌;菌根真菌
甘草是豆科甘草屬(Glycyrrhiza)植物，其根及根莖為常用中藥，市場需求量大。近年來，隨著野生甘草資源的急劇減少，且國家明令禁止采挖野生甘草，使甘草供求矛盾日益尖銳。在這種情況下，對甘草資源的保護性利用及栽培甘草勢在必行。近年來，隨著人工甘草種植面積的逐年加大，提高甘草的質量成為亟待解決的一個關鍵問題。相關研究表明，植物有益微生物可以產生促植物生長的活性物質，提高植物固氮性能，促進植物對惡劣環境的適應，加強系統的生態平衡，保障寄主植物健康生長。因此本文就近年來甘草有益微生物的研究進展進行綜述，以期對提高栽培甘草的質量有指導意義。
1甘草內生菌的研究現狀
內生菌是指一生或至少一生中的某個階段能進入活體植物組織內，并且不引起明顯組織變化的真菌或細菌［1,2］。1993年，Strobel等［3］從短葉紅豆杉TaxusbrevifoliaNutt的樹皮中分離出二百多種微生物，其中有一株內生真菌Taxomycesandreanae能產生紫杉醇，這一研究結果引起學者對內生菌的廣泛興趣。目前，人們已經從長春花、千層塔、銀杏、厚樸等多種植物中分離得到了內生菌，并取得了一些成果。
有學者對甘草內生菌也進行了研究，發現內生菌對甘草產生一系列作用。宋素琴等［4］對采自新疆的健康野生脹果甘草不同組織中的內生菌進行分離，并純化得到149株細菌和2株真菌，鑒定得出149株細菌分屬于13個屬，2株真菌分屬于青霉菌屬Penicillium和鐮刀菌屬Fusarium。有學者發現內生菌可通過拮抗病原菌促進甘草生長。饒小莉等［5］從烏拉爾甘草健康植株的根莖葉中共分離到內生細菌98株，并采用平板對峙方法篩選出6株菌株，其對植物病原菌有明顯體外拮抗活性，鑒定這6株拮抗菌株分屬萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、Paenibacillusehimensis。龔明福等［6］采用無菌操作技術從野生健康甘草Glycyrrhizauralensis的根、莖、葉、種子、根瘤等組織中分離出內生細菌（Endophyticbacteria)125株，其中31株對棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)具有較強的拮抗活性，這31株內生細菌分屬于氣芽孢桿菌屬(Aerobacillussp.)、氣單胞菌屬(Aeromonassp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、黃單孢桿菌屬(Xanthomonassp.)、假單胞桿菌屬(Pseudomonassp.)、土壤桿菌屬(Agrobacteriumsp.)。另有研究發現，從甘草中分離的有些內生菌還可產生活性物質。韋革宏等［7］從烏拉爾甘草和光果甘草中共分離得到68株內生菌，從中篩選出一個來自烏拉爾甘草的菌株Mesorhizobiumsp.CCNWGX022，從該菌株發酵液的石油醚提取物中分離得到了十八烷酸內酯Rhizobialide，是及時次從內生菌中得到此類物質。另有學者研究了內生菌在甘草不同部位及不同月份的數量變化趨勢。林世利等［8］分離出不同月份苦豆子、駱駝刺、苜蓿、鈴鐺刺、甘草不同部位的內生細菌，研究阿拉爾地區豆科植物內生細菌種群動態。結果顯示5月份的苦豆子和甘草植株、8月份的苜蓿植株、9月份的鈴鐺刺和駱駝刺植株的內生細菌的種類最多。內生細菌種類的分布規律依次為苦豆子中葉＞莖＞根＞種子＞花，苜蓿中根＞葉＞莖＞花＞種子，鈴鐺刺中莖＞葉＞種子＞花＞根，駱駝刺中根＞莖≥葉＞種子＞花，甘草中莖＞根＞葉＞種子＞花。5種豆科植物生長期中總帶菌量平均值在各個月份變化趨勢不同，并且各個月份的帶菌量處于交替變化之中，說明不同月份5種豆科植物內生細菌的種類和數量不同，同種豆科植物不同組織部位的內生細菌的種類和數量有差異。
2甘草根瘤菌的研究現狀
根瘤菌是與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養的一類桿狀細菌。這種共生體系具有很強的固氮能力。根瘤菌分快生和慢生兩種類型，為化能異養菌。目前有學者已經從甘草中分離得到根瘤菌并進行了一些相關研究。
目前對甘草根瘤菌的研究多體現在根瘤菌的分類上。楊雪穎等［9］通過對西北干旱半干旱地區68株甘草根瘤菌的表型多樣性和抗逆性分離研究，發現1個新類群和1個具有較高抗逆性的菌株。對新類群的中心菌株CCNWGX022和高抗性菌株CCNWGX035進行16SrDNA全序列測定及系統進化研究。結果表明，CCNWGX022和CCNWGX035與中慢生根瘤菌屬內參比菌株的16SrDNA相似性分別大于96.8％和98.3％，判定它們均屬于中慢生根瘤菌屬。谷峻等［10］采用表型數值分類、16SrDNAPCR-RFLP分析和BOX-PCR指紋圖譜分析的方法對中國北方地區的甘草根瘤菌進行表型、遺傳多樣性分析。供試菌株在數值分類聚類分析中約85％的相似水平上產生2個表觀群，有11株菌未與已知參比菌株聚群。16SrDNAPCR-RFLP分析表明，供試的20株菌共產生14種遺傳型，表現出豐富的遺傳多樣性。BOX-PCR指紋圖譜分析進一步證明與甘草共生的根瘤菌的基因組也具有多樣性。由此得出結論：在中國北方地區與甘草共生的根瘤菌在Sinorhizobium、Rhizobium和Mesorhizobium屬中均有分布。
3甘草菌根真菌的研究現狀
菌根是土壤中某些真菌與植物根的共生體。凡能引起植物形成菌根的真菌稱為菌根真菌，大部分屬擔子菌亞門，小部分屬子囊菌亞門。菌根真菌與植物之間建立相互有利、互為條件的生理整體，并各有形態特征，這是真核生物之間實現共生關系的典型代表。根據形態和解剖學的特征，又把菌根分為外生菌根和內生菌根兩大類。有學者對甘草菌根真菌進行研究發現菌根真菌可促進甘草的生長。饒小莉等［11］分離了甘草的VA菌根，并用三葉草進行單孢繁殖，將繁殖后的菌根真菌回接甘草，結果發現接種了菌根真菌的甘草植株筆長、根粗、莖葉干重和根干重都有較大程度的提高，均比對照顯著增加，并且不同處理對植株生長影響不同，得出結論接種VA菌根真菌顯著促進了甘草的營養生長。JingnanLiu等［12］用兩種AM菌根真菌Glomusmosseae與Glomusversiforme接種甘草，結果顯示接種的甘草相對于對照組在生長的早期和晚期有顯著提高，葉攝取磷的量比對照組多，并且根中甘草酸的濃度有所升高，但根部氧化酶活性相對降低了，由此得出結論接種AM菌根真菌有可能成為提高甘草藥用價值的有效途徑。
4甘草其他微生物學相關研究現狀
近年來，對甘草微生物學轉化等方面的研究工作也取得了一定成果。謝毛成［13］利用發根農桿菌的Ri質粒，以光果甘草種子胚萌發形成的實生苗不同部位為外植體，成功誘導出光果甘草毛狀根，并利用TLDNA中rolC序列中的特異性引物，應用PCR技術對光果甘草毛狀根進行了分子水平的鑒定，并利用理化手段對毛狀根轉化后產生的冠瘦堿進行了薄層定性鑒定，從不同水平上證實了光果甘草毛狀根核基因組中已整合了外源Ri質粒的T-DN段。燕飛等［14］利用發根農桿菌R1601對藥用植物脹果甘草(GlycyrrhizainflatBat)進行轉化，誘導其產生發根。在發根誘導過程中，分別用不同菌液濃度、不同浸染時間對脹果甘草子葉、胚軸進行轉化處理，統計、比較各條件下的發根率，結果表明，用稀釋2倍的菌液浸染子葉8min時，發根誘導率較高,為56.49%。何晨等［15］用一株產β-葡糖醛酸酶的菌種HC-12對甘草進行液體發酵轉化。通過對菌種復合誘變以及應用系統數值化及靈敏值系統調控技術優化了發酵工藝，把甘草中不足0.1%的甘草次酸的含量提高了20倍以上。經過柱層析及HPLC及1HNMR鑒定分離得到了甘草次酸純品，并通過動物實驗驗證了發酵甘草于未發酵的生品對照甘草具有抗炎活性和鎮痛作用顯著性效果。
5小結
內生菌對甘草的有益作用體現在：①內生菌有促進甘草生長作用，內生菌可與病原菌競爭營養或直接產生拮抗物質而抑制病原菌，從而促進甘草生長。②有些內生菌可產生活性物質。③內生菌在甘草不同部位及不同月份的數量呈現一定的變化趨勢。另有研究表明，內生菌能產生與宿主相同的活性物質［3］，王興紅［16］推測內生真菌可能與中藥的道地性有密切的關系。這些成果對于甘草內生菌的研究有重要意義。
根瘤菌對甘草的有益作用體現在：根瘤菌能夠通過與甘草共生，引起甘草根部或莖部結瘤，將空氣中的N2轉化為可吸收利用的NH4，從而為甘草提供氮素營養，促進其生長。
菌根真菌對甘草的有益作用體現在：甘草和菌根真菌是一種互惠共生的關系，它們之間可以交換各自所需的物質，甘草借助菌根真菌吸收水分、養分和生長促進劑，而菌根真菌也從甘草中攝取自身生長所需要的糖分和其它有機物。菌根真菌是根系的延長和擴展，且比根系吸收水分、養分的能力大得多，可促進甘草的營養生長，提高甘草的藥用價值。
微生物轉化對甘草的作用體現在：對甘草進行微生物轉化，可提高其有效成分含量，用藥效果可得到提高。
總之，微生物是個潛力巨大、尚待開發的資源，對甘草相關微生物進行研究有重大意義，有利于提高甘草的質量，對于中藥的可持續發展也將起到重大作用。
微生物論文:醫學微生物學臨床的醫學論文
“興趣是好的老師”。在教學中,教師如何激發學生的學習興趣,培養其對醫學微生物學的興趣和熱愛,是學好醫學微生物學的動力源泉。在對教學工作的不斷探索和改革中我們發現,首次的緒論課會給學生帶來先入為主的影響,關系到學生對教師及課程的評價,直接影響學生對課程的學習積極性和主觀能動性。通過緒論課可以啟發學生的學習動機,激發他們的學習興趣。同時,在緒論課上可以設置一些問題(如人體自身腸道中的微生物與機體組織之間存在怎樣的相互作用?微生物的耐藥性是怎么產生的,我們應該怎樣解決耐藥現象日益嚴重這一問題?曾經一度被控制的傳染病又開始死灰復燃,原因是什么,我們應該如何應對?),在后續的授課過程中逐漸揭開謎底。這樣帶著問題開展學習,可以較好地啟發學生的學習積極性,讓學生主動開啟微生物知識的大門。近年來由病原微生物引起的傳染病嚴重威脅著人類的健康,大量的新聞報道使學生對這些病原微生物有了一些粗淺的認識,將這些內容加入課堂教學內容中不僅可以增強學生學習的興趣,使內容變得更加生動,而且使學生充分認識到微生物原來距離我們如此之近,使理論知識找到實際落腳點。比如2010年8月,美國雞蛋因受沙門氏菌污染從而導致至少1300人受到沙門氏菌的感染。2011年,德國下薩克森州的豆芽被腸出血性大腸桿菌EHEC污染,從而造成22人因生食豆芽死亡,2200人住院治療。此外,還有近來流行的H7N9病毒、埃博拉病毒等。我們通過這些公共衛生事件的引入,講解相關病原微生物的生物學性狀、致病性及免疫性、微生物學檢查法及防治原則,使學生有強烈的探索欲望,有效提高了課堂學習效率。
2靈活多樣,結合臨床,增強學生的主觀能動性
教學方法的選擇應根據不同的認知對象、不同的學科、同一學科的不同內容從而選擇不同的方法,但不管采取何種教學方法,關鍵在于把課上活,充分調動學生參與教學的積極性。因而根據教學內容的不同,我們采取了多種教學方法。如對于細菌的形態和結構這一章節內容,采用直觀的多媒體教學可以讓學生形象地看到各種細菌的形態、基本結構及特殊結構;在細菌各論部分,選取部分教學單元由學生自主教學。教師事先根據教學目的、教學內容提出授課提綱、學習重點及難點并確定人員分組。小組成員細致分工、相互協作,在課后完成資料素材收集及教學課件的準備。在此期間,教師與學生進行充分溝通,及時為學生排疑解惑,引導學生在教學大綱的框架下安排課堂講授內容,并傳授講課技巧及注意事項。同時設計《學生自主學習實踐評價標準》,由學生從教學內容安排、課件制作、語言表達等多方面互相進行評議、分析和總結,教師進行點評總結。這種教學方式一方面活躍了課堂氣氛,加深學生對所學知識的理解,增強了學生的團隊意識,另一方面也可以讓教師在與學生的互動中、從學生獨特的視角中發現許多平時不會思索的問題;在學習引起人類疾病的常見病毒這一部分內容時,采取專題討論方式進行學習。專題討論式學習由教師提出專題,分組學生在本專題內提出應深入討論的問題,查資料,作綜述,課堂進行討論。例如“人類免疫缺陷病毒”的討論式教學,學生提出一系列問題,如HIV-1感染的分子機制及免疫反應、T細胞功能受損的疾病、HIV疫苗的研究等,經過討論,不僅完成了教學內容,而且為學生提供了一次“綜述訓練”的機會,教學效果令人滿意。此外,作為一門與臨床學科關系十分緊密的基礎課程,我們在教學過程中十分注重微生物學知識的臨床應用,采用PBL教學法將臨床病例分析引入課堂討論教學,由病引入菌,菌中解析病,菌病結合,解除病菌。如此,在整個講授過程中就將病原微生物的生物學特性、致病物質與致病機制、檢查及防治原則講解清楚。
3反映前沿,開闊視野,培養學生創新能力
在教學過程中,既要將教材中最基本、最核心的理論知識傳授給學生,為學生自主學習打下堅實的基礎,同時要補充一些開拓性、時代性和應用性較強的學科前沿內容。如微生物的耐藥性這一章節,我們為學生播放與耐藥機制相關的視頻和短片,引導學生就微生物耐藥機制的產生及防控進行積極的討論,鼓勵學生查閱耐藥機制近期的高質量學術論文并就學習心得進行討論交流,取得了良好的效果。此外,在授課過程中結合教研室老師的科研方向,為學生講授該領域的研究進展,如人體微生態學與免疫性疾病的相關性研究進展、新出現的傳染病病原體、流行性感冒病毒的研究進展等教材中鮮有介紹的前沿動態,從而啟迪學生思維,拓寬學生的知識面。同時鼓勵學生積極參與教師的科研課題,通過進行科學實驗研究進一步激發學生學習微生物學的興趣及愛好,培養學生發現問題、解決問題的能力和創新能力,提高學生綜合素質。
4利用網絡,練習鞏固,搭建師生交流的良好平臺
我校于2006年底引入Blackboard教學教育平臺,以整合學校所在的杭州濱江高教園區知識管理系統為載體,在園區師生中普及終身學習的觀念;培養學生自主學習、探究性學習和協作學習的方法;改變教師的教學觀念和教學方法,強化師生交流互動,調動學生參與、協商教學改革,不斷改善師生的教學關系;引導、鼓勵品質教學資源的共建共享,提高師生教學資源與占有水平,實現教育資源的拓展。本教研室針對五年制學生基礎較好、學習能動性較高的特點,讓學生利用Bb平臺以及互聯網其他資源,結合案例式教學,對醫學微生物學課程教學模式進行改革。以問題為基礎,讓學生處于一個將來知識被應用時相似的環境中,促進學生從不同角度思考問題的能力、加強自我指導性學習、問題解決技巧等能力,充分激發了學生的學習興趣及積極性。同時,教研室利用Excel表格建立課程選擇題題庫,用Excel函 數與宏語言構建選擇題練習程序。機組選項題的選項由程序根據知識庫計算組合而成,實現考查內容的“72變化”,有利于考查學生對特定具體學科問題的掌握能力,并防止了考試對知識的簡單再現,以及學生對知識的死記硬背。這種題型設計靈活,考核的內容源于大綱、教材,但又不拘泥于大綱和教材,擺脫了教材文字的束縛,更有利于考查學生的學科綜合能力。在此基礎上我們將選擇題練習程序改進成可利用計算機局域網進行課程選擇題的練習系統,并在教學實踐中得以應用。選擇題庫設計成游戲模式,根據獲得的分數和難度進級,極大地刺激了學生的學習興趣,寓教于樂。我們將攻關練習題庫分割成五級:1級0-20分;2級21-40分;3級41-70分;4級71-90分;5級91-100分,可將此部分內容作為平時成績的一部分,計入的考核成績。我們在醫學微生物學教學過程中,一直遵循“學生是教學主體”,并始終貫穿“互動”的教學理論。為了培養高素質人才,在教學中我們還需要繼續探索合適的教學方法及教學模式,學習國內外先進的教學理念及教學方法,注重知識更新,緊跟學科發展的步伐,通過不斷的學習進一步提高教師自身的綜合素質,這樣才能更好地指導學生探索微生物世界的奧秘。
微生物論文:中醫學專業微生物及免疫學教學體會
微生物及免疫學屬于醫學基礎課,具有名詞多、描述多、概念抽象、難記憶、難理解等教學特點,理論相對枯燥,實踐性不強,是醫學院校學生普遍感到難學的課程[1],對于文科生占大多數的中醫專業學生來說就更是難上加難,在學習過程中,學生對過難、過深的東西都不會感興趣。因此結合中醫專業學生的特點,進行教學方法的改進,來提高他們學習這門課程興趣和主動性。
中醫專業的學生特點是學生家庭以從事醫務和知識分子為主,尤以中醫名家子弟較為突出;而生源結構中以城市、文科及女生人數相對偏多[2]。據統計我校中醫專業文科生能占75%,而女生人數可以達到70%。針對中醫專業學生的特點,在微生物及免疫學教學過程中進行教學方法的改革來提高教學效果。
1.找到兩者共同點—類比(利用優勢攻克難點)
醫學院校招文科生多,主要是因為中醫學在其長期的發展中受到了古代哲學的深刻影響。中醫藥及相關專業學科具有特殊的人文哲學屬性[3]。其吸收了古代盛行的哲學思想如精氣、陰陽、五行等,并以這些理論為基礎,構建自己獨特的理論體系,是古代多學科交互滲透的產物[4]。所以可以看出中醫學理論是在中國的歷史文化背景下的蘊育而出的。而文科生文史知識豐富、善于閱讀、思維活躍,考慮這方面因素,文科生能夠比較好的理解中醫理論。這是文科生的優勢。并且中醫的基礎理論在大一就已經學過了,包括醫古文、中藥、方劑等課程已經學過,中醫對他們的熏陶已經使學生對其很認可了,所以利用他們已知的和熟悉的知識理論來類比性的介紹新的知識,理解起來較為容易一些。
例如中醫理論是建立在陰陽五行這種樸素的哲學理念上的,中醫講究的是陰陽平衡(包括人體內部和環境),而微生物及免疫學實際上也講究平衡,講究病原微生物與人體免疫系統的平衡,以及病原微生物之間及外界環境之間的平衡。這一點使他們的最基本的共同點。所以在講課時把微免的這些平衡與中醫的陰陽平衡進行類比的方式進行講授,受到學生的認可。在講消毒和滅菌的這一章時可以強調對于病原微生物與我們人類并不是你死我活的狀態,而是我們也要與它們保持平衡,因此在不同的時期,根據不同的目的,我們是要采取不同的消毒滅菌的方式是來保持這種平衡,而并不是一味的殺死病原微生物。緊接著舉一些例子來證明。例如我們生病了,進行輸液時,這個注射用的生理鹽水一定是無菌的,因為生理鹽水是要進入我們的血循環中的,血循環是沒有任何細菌的,為了不破壞這樣的平衡,我們注入血循環中的任何藥物都必須是無菌的。但是對于人體的有些部位,例如女性的陰道,本身就有大量的細菌,是以乳酸桿菌為主,有些女性經常沖洗陰道,破壞了陰道本身的平衡,反而容易得陰道炎。就這些生活中生動的例子可以讓學生感受到人體的這種微生態的平衡與中醫上講陰陽平衡很相似,無論哪種平衡被破壞都會引起疾病,這樣理解起來也就不困難了。在微生物及免疫學的整個授課過程中不時的去穿插一些學生熟知的中醫理論知識,可以進行類比。微免課程探討的就是病原微生物與人體免疫系統的相互作用,其相互作用的最終是——平衡或不平衡。這要求教師大概了解中醫理論的知識。
2.在緒論中介紹背景知識
中醫專業學生因為沒有相關學科的背景知識,有相當一部分學生反映上課聽不懂。即認知結構中沒有適當的起鞏固作用的知識觀念可利用,阻礙了新的學習與保持,因此提供背景信息及相關的概念將有助于啟動他們的學習[5]。例如在課堂上加入一些本學科的背景知識教學效果較好。對于大多數是文科生的中醫專業學生來說,他們的想像力是十分豐富的,需要教師去組織語言,可以通過這幾點來將微免的發展簡史講的生動而具體:人類在沒有發現微生物時對疾病的看法,以及人類是怎樣發現微生物的,以及是怎樣把它和疾病聯系到一起的,是怎樣來尋找預防和治療的方法。做好這一點,對于提高學生學習本門課程有很大的幫助。
3.增加內容的趣味性
在授課過程中,可以用一些小故事、圖片、視屏、生活(增加與原有知識相關性)等各種方式來提高課程內容的趣味性。偉大的科學家愛因斯坦說過:“興趣是好的老師”。 興趣是學生學習的動力和加速劑,是一切創新動力的重要源泉,是學生掌握知識,發展智力,形成創新能力的內在動力[6]。例如介紹培養基時,可以將科赫發明培養基的過程較詳細的講給學生,不單單增強內容的趣味性,而且在這些發明的過程中滲透了很多科學家的的科學素質和道德品質,無形中對學生的科學素質和道德品質有了一定的影響。課堂上還可以應用多媒體播放一些相關視屏,例如在講到流感病毒時,播放了一個《流行感冒的發病過程》的視屏,受到學生的歡迎,因為在視屏中病毒不再是看不見摸不到的,甚至在免疫學中的免疫細胞也是栩栩如生的,是學生有耳目一新的感覺,甚至突然對微免學茅塞頓開感悟。在上的每一次課中去花一些心思來設計好每一次課的引課,也是可以較好的提高學生的學習興趣。中醫專業學生條理性的思維可能比理科學生占多數的一些專業的學生稍遜色,但發散性的思維較好,介紹課程中的與人文科學相關的內容,用一些有趣的、能打動學生的歷史過程,喚起學生的求知欲效果較好。
4.介紹書籍網站
閱讀是人類社會中不可缺少的一種認知活動, 是人類汲取知識的重要手段和認識周圍世界的途徑之一, 是學習所有學科的基礎[7]。文科生較多的中醫專業學生的閱讀能力較強,可以通過介紹與之相關的有趣的的內容來開闊學生的視野。可以向學生介紹相關課外書籍和網站。這樣做可以使學生的視野開闊,相當于本課程是一個原點,以這個原點向外發散出去,了解了相關內容,再回到原點,則感覺課本中的內容并不是難以理解和枯燥,這樣學生就會覺得學這門課程很輕松。
綜上說述,結合中醫專業學生特點,利用其特點進行一些教學方法的改進,的確可以讓學生不再覺得微生物及免疫學是比較枯燥、抽象和難學的一門課程。實際上中醫學與微生物及免疫學都與哲學有很多聯系。愛因斯坦這樣談論哲學:如果把哲學理解為在最普遍和最廣泛的形式中對知識的追求,那么,哲學顯然就可以被認為是全部科學之母學。在課堂內容中加進些人文性的(包括哲學,科學,思想、人文素質等)知識,有助于提高學生各方面能力。
微生物論文:微生物常規鑒定的技術
一、形態結構和培養特性觀察
1、微生物的形態結構觀察主要是通過染色,在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構(包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進行觀察,直觀地了解細菌在形態結構上特性,根據不同微生物在形態結構上的不同達到區別、鑒定微生物的目的。
2、細菌細胞在固體培養基表面形成的細胞群體叫菌落(colony)。不同微生物在某種培養基中生長繁殖,所形成的菌落特征有很大差異,而同一種的細菌在一定條件下,培養特征卻有一定穩定性。,以此可以對不同微生物加以區別鑒定。因此,微生物培養特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。
1)細菌的培養特征包括以下內容:在固體培養基上,觀察菌落大小、形態、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養中的表面生長情況(菌膜、環)混濁度及沉淀等。半固體培養基穿刺接種觀察運動、擴散情況
2)霉菌酵母菌的培養特征:大多數酵母菌沒有絲狀體,在固體培養基上形成的菌落和細菌的很相似,只是比細菌菌落大且厚。液體培養也和細菌相似,有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體,菌絲粗長,在條件適宜的培養基里,菌絲無限伸長沿培養基表面蔓延。霉菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色,因而菌落邊緣和中心,正面和背面顏色常常不同,如青霉菌:孢子青綠色,氣生菌絲無色,基內菌絲褐色。霉菌在固體培養表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網狀菌落。
二、生理生化試驗
微生物生化反應是指用化學反應來測定微生物的代謝產物,生化反應常用來鑒別一些在形態和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類鑒定中的重要依據之一。
微生物檢驗中常用的生化反應有:
1、糖酵解試驗
不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產氣或不產氣。可用指示劑及發酵管檢驗。
試驗方法:以無菌操作,用接種針或環移取純培養物少許,接種于發酵液體培養基管,若為半固體培養基,則用接種針作穿刺接種。接種后,置36±1.0°C培養,每天觀察結果,檢視培養基顏色有無改變(產酸),小倒管中有無氣泡,微小氣泡亦為產氣陽性,若為半固體培養基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,有時還可看出接種菌有無動力,若有動力、培養物可呈彌散生長。
本試驗主要是檢查細菌對各種糖、醇和糖苷等的發酵能力,從而進行各種細菌的鑒別,因而每次試驗,常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫,溴百里藍和An-drade指示劑。
2、淀粉水解試驗
某些細菌可以產生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再變藍色。
試驗方法:以18~24h的純培養物,涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板(一個平板可分區接種,試驗數種培養物)或直接移種于淀粉肉湯中,于36±1°C培養24~48h,或于20°培養5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養表面,若為液體培養物,則加數滴碘試劑于試管中。立即檢視結果,陽性反應(淀粉被分解)為瓊脂培養基呈深藍色、菌落或培養物周圍出現無色透明環、或肉湯顏色無變化。陰性反應則無透明環或肉湯呈深藍色。
淀粉水解系逐步進行的過程,因而試驗結果與菌種產生淀粉酶的能力、培養時間,培養基含有淀粉量和pH等均有一定關系。培養基pH必須為中性或微酸性,以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,因而以臨用時制備為妥。
3、V-P試驗
某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養基中能分解葡萄糖產生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強堿環境下,被空氣中氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱V-P(+)反應。
試驗方法:
1)O’Meara氏法:將試驗菌接種于通用培養基,于36±1°C培養48h,培養液1ml加O’Meara試劑(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液)1ml,搖動試管1~2min,靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,若4h內不呈現伊紅、即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h后判定結果者。
2)Barritt氏法:將試驗菌接種于通用培養基,于36±1°C培養4天、培養液2.5ml先加入5°Cα萘酚(2-na-phthol)純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,搖動2~5min,陽性菌常立即呈現紅色,若無紅色出現,靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,如2h內仍不顯現紅色、可判定為陰性。
3)快速法:將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產酸反應的三糖鐵瓊脂斜面培養物一接種環,乳化接種于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氫氧化鈉水溶液2滴,振動后放置5min,判定結果。不產酸的培養物不能使用。
本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細菌時,通用培養基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產生,故應省去或以氯化鈉代替。
4、甲基紅(Methyl Red)試驗
腸桿菌科各菌屬都能發酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產生丙酮酸,進一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產物,可使培養基PH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。
試驗方法:挑取新的待試純培養物少許,接種于通用培養基,培養于36±1°C或30°C(以30°C較好)3~5天,從第二天起,每日取培養液1ml,加甲基紅指示劑1~2滴,陽性呈鮮紅色,弱陽性呈淡紅色 ,陰性為黃色。迄至發現陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結果。
甲基紅為酸性指示劑,pH范圍為4.4~6.0,其pK值為5.0。故在pH5.0以下,隨酸度而增強黃色,在pH5.0以上,則隨堿度而增強黃色,在pH5.0或上下接近時,可能變色不夠明顯,此時應延長培養時間,重復試驗。
5、靛基質(Imdole)試驗
某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應表現出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。
試驗方法:將待試純培養物小量接種于試驗培養基管,于36±1C培養24h時后,取約2ml培養液,加入Kovacs氏試劑2~3滴,輕搖試管,呈紅色為陽性,或先加少量禁藥或二甲苯,搖動試管以提取和濃縮靛基質,待其浮于培養液表面后,再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數滴,在接觸面呈紅色,即為陽性。
實驗證明靛基質試劑可與17種不的靛基質化合物作用而產生陽性反應,若先用二甲苯或禁藥等進行提取,再加試劑,則只有靛基質或5-甲基靛基質在溶劑中呈現紅色,因而結果更為。
6、硝酸鹽(Nitrate)還原試驗
有些細菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。
試驗方法:臨試前將試劑的A(磺胺酸冰醋酸溶液)和B(α-萘胺乙醇溶液)試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養物或瓊脂斜面培養物表面,立即或于10min內呈現紅色即為試驗陽性,若無紅色出現則為陰性。
用α-萘胺進行試驗時,陽性紅色消退很快、故加入后應立即判定結果。進行試驗時必須有未接種的培養基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應加注意。
7、明膠(Gelatin)液化試驗
有些細菌具有明膠酶(亦稱類蛋白水解酶),能將明膠先水解為多肽,又進一步水解為氨基酸,失去凝膠性質而液化。
試驗方法:挑取18~24h待試菌培養物,以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養基。于20~22℃培養7~14天。明膠高層亦可培養于36±1℃。每天
觀察結果,若因培養溫度高而使明膠本身液化時應不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細菌液化,如確被液化,即為試驗陽性。平板試驗結果的觀察為在培養基平板點種的菌落上滴加試劑,若為陽性,10~20min后,菌落周圍應出現清晰帶環。否則為陰性。 8、尿素酶(Urease)試驗
有些細菌能產生尿素酶,將尿素分解、產生2個分子的氨,使培養基變為堿性,酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導酶,因為不論底物尿素是否存在,細菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。
試驗方法:挑取18~24h待試菌培養物大量接種于液體培養基管中,搖均,于36±1℃培養10,60和120min,分別觀察結果。或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面,不要到達底部,留底部作變色對照。培養2,4和24h分別觀察結果,如陰性應繼續培養至4天,作最終判定,變為粉紅色為陽性。
9、氧化酶(Oxidase)試驗
氧化酶亦即細胞色素氧化酶,為細胞色素呼吸酶系統的終末呼吸酶,氧化酶先使細胞色素C氧化,然后此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化,產生顏色反應。
試驗方法:在瓊脂斜面培養物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴,陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色,Ewing氏改進試劑呈藍色。陰性者無顏色改變。應在數分鐘內判定試驗結果。
10、硫化氫(H2S)試驗
有些細菌可分解培養基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。
試驗方法:在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養基中,沿管壁穿刺接種,于36±1℃培養24~28h,培養基呈黑色為陽性。陰性應繼續培養至6天。也可用醋酸鉛紙條法:將待試菌接種于一般營養肉湯,再將醋酸鉛紙條懸掛于培養基上空,以不會被濺濕為適度;用管塞壓住置36±1℃培養1~6天。紙條變黑為陽性。
11、三糖鐵(TSI)瓊脂試驗
試驗方法:以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養物,穿刺接種并涂布于斜面,置36±1℃培養18~24h,觀察結果。
本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發酵產酸或產酸產氣(變黃);產生硫化氫(變黑)。葡萄糖被分解產酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細菌利用培養基中含氮物質,生成堿性產物,故使斜面后來又變紅,底部由于是在厭氧狀態下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。
12、硫化氫-靛基質-動力(SIM)瓊脂試驗
試驗方法:以接種針挑取菌落或純養物穿刺接種約1/2深度,置36±1℃培養18~24h,觀察結果。培養物呈現黑色為硫化氫陽性,混濁或沿穿刺線向外生長為有動力,然后加Kovacs氏試劑數滴于培養表面,靜置10min,若試劑呈紅色為靛基質陽性。培養基未接種的下部,可作為對照。
本試驗用于腸桿菌科細菌初步生化篩選,與三糖鐵瓊脂等聯合使用可顯著提高篩選功效。
三、血清學試驗
血清學反應是指:相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用,可出現肉眼可見的沉淀、凝集現象。在食品微生物檢驗中,常用血清學反應來鑒定分離到的細菌,以最終確認檢測結果。
血清學反應的一般特點:
1)抗原體的結合具有特異性,當有共同抗原體存在時,會出現交叉反應。
2)抗原體的結合是分子表面的結合,這種結合雖相當穩定,但是可逆的。
3) 抗原體的結合是按一定比例進行的,只有比例適當時,才能出現可見反應。
4)血清學反應大體分為兩個階段進行,但其間無嚴格界限。及時階段為抗原體特異性結合階段,反應速度很快,只需幾秒至幾分鐘反應即可完畢,但不出現肉眼可見現象。第二階段為抗原體反應的可見階段,表現為凝集、沉淀、補體結合反應等。反應速度慢,需幾分、幾十分以至更長時間。而且,在第二階段反應中,電解質、PH、溫度等環境因素的變化,都直接影響血清學反應的結果。
習慣上將經典的血清學反應分三種類別:凝集反應、沉淀反應和補體結合反應。
1、凝集反應
顆粒性抗原(細菌、紅細胞等)與相應抗體結合,在電解質參與下所形成的肉眼可見的凝集現象,稱為凝集反應(Agglutination reaction)。其中的抗原稱為凝集原,抗體稱為凝集素。在該反應中,因為單位體積抗體量大,做定量實驗時,應稀釋抗體。
1)直接凝集反應
顆粒性抗原與相應抗體直接結合所出現的反應,稱為直接凝集反應(Direct agglution reaction)。
a.玻片凝集法。是一種常規的定性試驗方法。原理是用已知抗體來檢測未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。如將含有痢疾桿菌抗體的血清與待檢菌液各一滴,在玻片上混勻,數分種后若出現肉眼可見的凝集塊,即陽性反應,證明該菌是痢疾桿菌。此法快速、簡便,但不能進行定量測定。
b.試管凝集法。是一種定量試驗方法。多用已知抗原來檢測血清中有無相應抗體及其含量。常用于協助診斷某些傳染病及進行流行病學調查。如肥達氏反應就是診斷傷寒、付傷寒的試管凝集試驗。因為要測定抗體的含量,故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度,然后加入等量抗原,37℃或56℃,2~4小時觀察,血清較高稀釋度仍有明顯凝集現象的,為該抗血清的凝集效價。
2)間接凝集反應
將可溶性抗原(抗體)先吸附在一種與免疫無關的,顆粒狀微球表面,然后與相應抗體(抗原)作用,在有電解質存在的條件下,即可發生凝集,稱為間接凝集反應(Indirect agglutination)。由于載體增大了可溶性抗原的反應面積。當載體上有少量抗原與抗體結合。就出現肉眼可見的反應,敏感性很高。
2、沉淀反應
可溶性抗原與相應抗體結合,在有適量電解質存在下,經過一定時間,形成肉眼可見的沉淀物,稱為沉淀反應(Precipitation)。反應中的抗原稱為沉淀原,抗體為沉淀素。由于在單位體積內抗原量大,為了不使抗原過剩,故應稀釋抗原,并以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價。
1)環狀沉淀反應:是一種定性試驗方法,可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中,然后沿管壁徐徐加入等量抗原,如抗原與抗體對應,則在兩液界面出現白色的沉淀圓環。
2)絮狀沉淀反應:將已知抗原與抗體在試管(如凹玻片)內混勻,如抗原抗體對應,而又二者比例適當時,會出現肉眼可見的絮狀沉淀,此為陽性反應。
3)瓊脂擴散試驗:利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內擴散,若抗原抗體對應,且二者比例合適,在其擴散的某一部分就會出現白色的沉淀線。每對抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對抗原抗體,就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴散可分為單向擴散和雙向擴散兩種類型。單向擴散是一種定量試驗。可用于免疫蛋白含量的測定。而雙向擴散多用于定性試驗。由于方法簡便易行,常用于測定分析和鑒定復雜的抗原成分。>
3、補體結合反應
補體結合反應(Complement fixation reaction)是在補體參與下,以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統的抗原抗體反應。補體無特異性,能與任何一組抗原抗體復合物結合而引起反應。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的復合物結合,就會出現溶血現象,如果與細菌及相應抗體復合物結合,就會出現溶菌現象。因此,整個試驗需要有補體、待檢系統(已知抗體或抗原、未知抗原或抗體)及指示系統(綿羊細胞和溶血素)五種成份參加。其試驗原理是補體不單獨和抗原或抗體結合。如果出現溶菌,是補體與待檢系統結合的結果,說明抗原抗體是相對應的,如果出現溶血,說明抗原抗體不相對應。此反應操作復雜,敏感性高,特異性強,能測出少量抗原和抗體,所以應用范圍較廣。
微生物論文:根際微生物群落與促生菌多樣性及其篩選的理論綜述
1904年,德國農學家Hiltner發現豆科植物根附近區域的土壤微生物,由于受到根系分泌有機物質對其產生的“效應”,表現出相對更高活性的現象,并首次提出“根際”(Rhizosphere)這一概念[1]。現在我們知道,這種“效應”其實是根際微生態系統中的根際效應。單棵植物根際范圍雖小,但放眼看,根際卻是地球上較大的生態系統,其能量流也極其巨大,因而,根際在生物圈功能中的作用非常顯著。曾有研究人員估算,植物20%~50%的光合產物是通過根部釋放出來的[2,3]。
根際土壤中存在大量的宏觀生物和微生物,如細菌、真菌、原生動物和藻類生物等,細菌是該群體中數量最多的一類微生物。微生物和植物在根際環境中形成的復雜網絡式關系會直接和間接地影響植物生長;反過來,植物通過分泌有機物,構建起一個有選擇性的環境條件,以利于對其生長有益的細菌,導致根際細菌多樣性偏低[4,5]。植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)在根際微生物群體中研究最為熱門,也是對農業生產具有應用價值的一類微生物。由于PGPR數量眾多,且在根際定殖時具有競爭力,加之其作用機制的多樣性,因此能在很大程度上影響植物生長。然而,人們在使用PGPR或相關制劑時,普遍發現大田應用效果遠不及盆栽或溫室條件下的效果理想,主要原因是PGPR對“陌生”環境的不適應。根際微生物是野外環境中的主要“陌生”因素,因此,了解與某些基本生態過程,如復雜性、自然選擇、種間關系(共生、寄生、共棲和競爭)、演替或擾動效應有密切關系的根際微生物群落結構和多樣性,可以幫助人們更好地理解根際生態系統,并為PGPR的篩選和高效利用提供理論依據。基于此,本文主要從根際微生物群落多樣性、PGPR生態和遺傳多樣性以及PGPR的篩選策略等3個方面進行綜述。
1 根際微生物群落多樣性
微生物多樣性包括物種、遺傳與變異以及功能多樣性[6]。在根際系統中,細菌群落的功能多樣性是基于其遺傳變異以及和其他原核、真核生物(如植物)的互作關系。直至現在,根際微生物多樣性與根際微生物功能之間的關系仍不十分清楚。根際微生物多樣性信息的缺乏,其原因一是其種類繁多,二是絕大多數微生物的不可培養性。
1.1 根際微生物群落結構的研究方法
研究微生物群落結構,就必須了解各類群微生物群體的種類及數量。傳統技術是通過從根際土壤中提取、分離微生物,實驗室條件下對其進行形態學、生化和遺傳學檢驗。由于細菌往往和土壤基質以及其他細胞緊密附著,因此在細菌提取中常用到分散劑,即用物理或化學方法將細胞和基質區分開,之后才能對分離細菌生物量進行測定。
微生物生物量的測定常用方法有:顯微鏡下直接計數(如吖啶橙染料染色)[7]、微生物呼吸量測定(如基質誘導呼吸量,Substrate induced respiration,SIR)[8]、ATP含量測定[9]、較大或然法(Most probable number,MPN)計數[10],使用脂類生物標志物[11]以及氯仿土壤熏蒸法[12]等。但是,土壤中可培養微生物比例畢竟極低。有研究者曾估算這一比例只有不足1.0%(0.2%~0.8%)[13]。正因為如此,基于平板培養法研究土壤微生物多樣性存在重大缺陷,免培養技術順應而生。所涉及的技術包括磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid analysis,PLFA)分析法[14-16]、DNA/RNA雜交[17]、聚合酶鏈反應(Polymerase chain reaction,PCR)、核糖體RNA測序[18]、(G+C)含量[19]、溫度梯度凝膠電泳(Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE)和變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)、限制片段長度多態性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)[20,21]、DNA微陣列(DNA microarray)[22]技術(又稱“DNA陣列”或“DNA芯片”)、克隆文庫分析等方法。過去20多年間,人們利用這些技術手段揭示了很多有關土壤微生物群落的信息[23]。這些方法各有優缺點,正確選擇合適的方法進行研究,有助于更地了解根際土壤微生物群落結構特征。
1.2 根際微生物活性和功能多樣性的研究方法及根際PGPR活性
研究根際微生物活性的經典方法,是將細菌進行培養、分離并作理化試驗。另一個方法是利用細菌在不同培養基上的生長速率來表征該菌在環境中的生理特性、養分利用特點和自適應策略[24]。
目前,人們廣泛采用某一關鍵酶活性的測定來表征某類群微生物的多樣性和代謝活性。此外,Biolog體系也是應用較為廣泛的方法之一[16,25]。另外,通過克隆構建大片段DNA文庫(如BAC library),有助于更地揭示土壤中可培養和不可培養微生物,以及土壤微生物生態系統的相關信息[22]。未來土壤微生物群落結構的研究無疑會大量運用DNA微陣列技術[22],因為該技術可以利用其高特異性特點,將不同活性微生物區分開,并有助于解釋同一菌株在不同環境土壤樣本中的生態位的異同。當然,基因轉錄、蛋白質組學等技術也是未來微生物學研究中不可或缺的輔助手段[22,26]。
根際微生物多樣性反映了微生物群落的代謝活躍程度。在土壤中接種PGPR,只要能存活,無論是否改變微生物群落結構,都會在一定程度上影響群落的代謝活性[15]。因此,接種PGPR是否能在土壤中存活并競爭是一個十分關鍵的問題,受物理的(質地、溫度和濕度等)、化學的(pH、養分的可利用性、有機質含量等)以及和根際其他微生物之間的互作關系等因素的影響。其中,PGPR與根際土著微生物的互作關系是一個十分重要的影響因子,因為接種PGPR需要在根際形成新的生態位,并在根際定殖,且能競爭足夠的養分。總之,接種PGPR后,要能以有限的群體發揮應有的生物效應。
目前,人們可借助多種技術研究根際土壤微生物活性,比如前面介紹過的同位素(3H、14C)標記DNA的胸腺嘧啶核苷或蛋白質的亮氨酸組分,來估算群落代謝活性和生長狀況[7,27]。此外,還可以用SIR技術定量測定根際微生物活性[8]。
2 PGPR生態及遺傳多樣性
近些年來,由于人們愈加深刻地認識到根際生態系統的重要性,加之PGPR作用機制研究的不斷深入[28],越來越多的PGPR被篩選出來并加以鑒定。從結果看,很多屬都有PGPR的分布。下面以目前PGPR相對集中的幾個屬來闡述其生態特征和多樣性。
2.1 固氮PGPR(Diazotrophic PGPR)
自生固氮菌大概是首個被發現具有促生作用的根際微生物。自20世紀70年代,固氮螺菌屬(Azospirillum sp.)的菌株就已被分離出并應用于實踐[29]。其他還有能起促生作用且能自生固氮的屬種主要有固氮弓菌屬(Azoarcus,Az onexus,Azospira)[30]、布克氏菌屬(Burkholderia sp.)、重氮營養葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、草螺菌屬(Herbaspirillum sp.)、固氮菌屬(Azotobacter sp.)和多黏類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)等[31]。上述這些細菌可以從許多種類植物,包括水稻、甘蔗、玉米、高粱以及其他谷物,甚至菠蘿、咖啡豆的根際分離到。
最近,固氮弓菌因其遺傳和代謝多樣性而逐步引起研究者的關注。該屬細菌能生長在以羧酸類或乙醇為碳源的培養基上,而且最適生長溫度在37~42 ℃。
2.2 桿菌(Bacillus)
土壤中的G+桿菌有95%屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp.),其余5%屬于節桿菌(Arthrobacter)和弗蘭克氏菌(Frankia)[32]。許多桿菌能在逆境下形成芽孢以增強生存能力,一些桿菌如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)還具有固氮能力[33]。桿菌類的PGPR具備多種促生能力[14,34,35]。
2.3 假單胞菌(Pseudomonas)
在植物根際土壤G-細菌中,假單胞菌是數量最多的一類,該屬中的PGPR也因為促生能力廣泛而被人們所熟知[14,36,37]。假單胞菌屬細菌生態多樣性豐富,國內外已經從許多植物根際土壤中分離出大量該屬的細菌。假單胞菌細菌往往代謝功能多樣,可以產生抗生素、嗜鐵素或氰類化合物等多種代謝物[38]。這些代謝物通過抑制其他有害微生物以及幫助植物吸收土壤養分,從而影響根際生態環境。
2.4 根瘤菌(Rhizobia)
這里提及的根瘤菌是指能在非豆科植物根際進行非特異性定殖,并釋放促生調控因子,如嗜鐵素、氰類化合物或進行溶磷等作用,提高土壤養分的可利用性[39]。已有報道指出,在作物和一些非豆科植物輪作后,其根際微生物數量會大幅增加[40],這對隨后的作物生長十分有益[41]。
3 PGPR篩選策略
由于野外植物根際土壤是PGPR高密度集中地,因此該區域成為篩選PGPR的來源地。進行篩選工作時,不同土壤類型、植物種類、季節以及植物生長期都必須考慮,以保障篩選到最多的菌株。且一般土壤根際有2%~5%的細菌屬于PGPR。由此可見,野外植物根際是篩選PGPR的來源地[4,42]。細菌成為PGPR的先決條件是,當被接種后,能在根際土壤微生物群體中表現出相當的競爭力。
篩選PGPR的及時步工作,是獲得足夠多的根際土壤細菌。通常認為根際土壤是指緊密附著在植物根表(1~3 mm區域)的土壤。試驗中,通常將植物根表土壤劇烈抖
精品源自地理科精品源自地理科
掉后,仍緊密附著的土壤作為根際土壤,用于篩選工作。當然,根據研究需要,除了根際土壤細菌,也可篩選根際內生細菌,因為這部分細菌也有不少是PGPR。也有一些研究者將植物根用自來水輕柔沖洗,仍附著的土壤被看作根際土壤而進行PGPR篩選。
根際土壤充分懸浮于無菌水、磷酸緩沖液或生理鹽水。一些化合物如焦磷酸鹽可作為土壤分散劑,但也可以影響細胞膜的通透性[43]。一些化學分散劑,如螯合劑可以用單價的陽離子(Na+)交換土壤顆粒的多價陽離子(Ca2+),從而減弱土壤顆粒對細菌細胞的離子吸附作用。不少研究者用亞氨基二乙酸制成的離子交換樹脂,如Dowex A1[44]或Chelex-100[45,46]。其他的一些分散劑有Tris緩沖液或六偏磷酸鈉[47]。由于微生物細胞被其胞外聚合物緊密附著于土壤顆粒,有時也會使用去污劑。Macdonald[44]曾用0.1%的脫氧膽酸鈉作為去污劑,同時用Dowex A1作分散劑處理,土壤微生物的浸出率可提高84%。后來,Herron等[45]將此方法作了改進,用Chelex-100替代Dowex A1,同時用聚乙二醇6 000(PEG 6 000)溶解并分散土壤微生物。還有人在用吖啶橙染色計數土壤細菌數量時,用0.2%的六偏磷酸鈉作為溶劑[10]。此外,檸檬酸鹽緩沖劑作土壤溶劑研究微生物細胞膜磷脂特性[48],Winogradsky溶液用于分子生物學手段(ARDRA、DGGE或REP-PCR等)研究微生物多樣性。
化學浸出法一般要結合物理法,可分為3類:搖蕩法、混合法(均質或研磨)和超聲波法。搖蕩法是這3種方法中效率低但卻適用于一些敏感型的細菌或噬菌體。均質化處理會破壞一些細胞結構,特別是G-細菌,導致浸出液具有選擇性。輕微均質化處理結合化學分散劑的使用往往具有更高的效率[49]。超聲波處理是這3種方法中效率較高的方法,但對一些黏性土壤,需要對樣品進行預處理[50]。然而,很多如G-的敏感型細菌會在處理過程中遭到不同程度的破壞,當然,選擇較小頻率的超聲波處理可以避免這一情況的發生。
當獲得足夠多的根際細菌后,有如下兩個策略可以篩選到所需的PGPR:①根據前文介紹的PGPR一般比較集中的幾個屬,通過選擇性培養基和培養方法篩選目標PGPR。例如,Founoune等[51]用選擇性培養基將熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)從刺槐根際篩選出來;②將所得到的根際細菌進行體外促生能力測定,保留具有促生潛力的菌株。然后對所得菌株進行遺傳學試驗,剔除同一屬里相似的一些菌株,盡可能獲得多個屬里不同功能的有益菌[42,52,53]。
上述的體外促生能力試驗包括:①測定促進植物生長的一些激素(如茁長素、赤霉素、細胞分裂素和生長素等);②1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶(ACC脫氨酶,1-Aminocyclopropanecarboxylic acid)活性檢測,該酶能降解乙烯前體ACC,從而降低植株體內乙烯的水平,促進根系發育[54];③溶磷能力測試,細菌的溶磷能力有助于植物吸收磷素[55];④產嗜鐵素能力測定,能幫助植物吸收鐵質[56];⑤固氮能力測定[31];⑥測定細菌產生某些能降解病原真菌細胞壁的酶(如幾丁質酶或β-1,3-葡聚糖酶)[52]。
通過體外促生能力篩選PGPR是一條可行途徑,但也存在一定局限性。一些菌株的生化途徑是誘導型的,也就是說,一些功能在某一環境條件下是表達的,但換個環境或改變某個培養條件就不表達了。因此,試驗中往往會出現一些PGPR菌株在實驗室條件下是有效的,但在根際條件下卻失去這種作用。比如,一些與土壤磷素或鐵質等養分相關的PGPR,往往在土壤磷素或鐵質含量豐富的情況下作用不明顯。
還有一個問題值得關注,一些具有抗病能力的細菌在傳代過程中,由于該菌產生的特異性轉化酶(Site-specific invertase)容易使其發生“相位變異”(Phase variation),當發生這種情況后,細菌的某些表型會發生重大變化。這也是一些細菌在實驗室條件下表現出PGPR特性,但一段時間后,促生能力卻消失的原因之一[57]。
篩選工作之后,對體外試驗獲得成功的PGPR菌株還應該在實際植物生長過程中起到相同的作用。值得注意的是,PGPR往往對不同的植物所起作用不同[58],但具體原因至今仍不清楚,此外PGPR在根際的競爭機制也不十分明了。接種PGPR可能會改變根際微生物群落,這有可能對植物間接促生[59]。當然,接種PGPR也不一定會改變根際微生物群落,也有可能只建立自身的群落,但并不改變根際微生物群落[59]。
最近的一些關于PGPR篩選的報道,都遵循上述策略。Kumar等[60]從生長在貧瘠土壤的番茄根際分離出細菌,再通過解磷、產IAA、產HCN、產嗜鐵素、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活性測定,確定多株細菌具有促生潛力,并在隨后的芝麻種植中進一步試驗,確立1株細菌(Pseudomonas aeruginosa LES4)具有明顯促生能力;Jha等[61]采集低氮土壤的水稻根際土壤,用不同碳源和不同pH的無氮介質進行富集培養,從中篩選出多株固氮細菌;Ahmad等[62]則采用3種選擇性培養基(Jensen’s medium, King’s B medium, Nutrient agar)分別將不同植物根際土壤的固氮菌、假單胞菌和芽孢桿菌分離出來,再通過上述常用的促生指標逐一進行鑒定,從而分離出目標PGPR。
4 展望
研究者對微生物生態學的研究逐漸趨熱,反映了微生物在生態系統中 的重要性。土壤微生物是生物圈中物質能量循環的重要組成成分,在植物根際,這一功能尤為顯著。植物通過根際分泌有機物質,高選擇性地選擇適合其健康生長的細菌,導致根際細菌多樣性減少,但卻為篩選植物根際促生菌提供了來源。
接種PGPR可能會對根際微生物群落產生影響,由于這種影響關系到PGPR的作用效果,因而需要對此詳加研究。另外值得關注的是,由于關系到PGPR和植物的互作關系,PGPR和其他微生物的“對話機制”(如群體感應等)值得進一步研究。
今后需要進一步加強根際微生物生態學研究,這有助于獲得一些不同功能的微生物,并幫助人們解決不同的環境問題。未來PGPR生態學研究會越來越多地應用一些先進技術,如DNA/RNA微陣列技術,更好地揭示PGPR結構及功能多樣性。此外,為提高PGPR的應用效果,細菌群體感應等機制還有待進一步研究。
微生物論文:不同培肥措施對新建設施土壤微生物產生的影響
自天津市“4412”工程啟動以來,設施農業面積逐年增加,加強新增部分設施農業基地土壤科學培肥顯得非常重要。傳統培肥措施普遍存在不考慮土壤理化性狀、生物性狀、結構等方面的破壞,只考慮短期效益,盲目大肥投入,培肥效果不穩定[1-3]。土壤微生物在土壤養分分解轉化過程中起著不可替代的作用。主要包括了細菌、放線菌和真菌,土壤細菌占土壤微生物總數量的70%~90%,放線菌約占土壤微生物總量的5%~20%。設施土壤與露地土壤相比環境條件發生了很大變化,主要是設施條件下獨特的小氣候條件和耕作強度,全年條件下高溫高濕和含有大量微生物的有機肥的施用都有利于微生物的生長、繁殖,加快土壤養分轉化,真正提高土壤肥力水平和土壤生物多樣性水平[4-5]。生物有機肥料是農業生產中重要的物質基礎,能為作物提供的營養,它肥效長,可以增加和更新土壤有機質,促進微生物繁殖,增強土壤保水保肥能力[6-7]。長期施用化肥,不僅消耗土壤有機質,導致地力下降,而且使單位化肥養分的增產率呈現遞減趨勢,并引起農產品品質下降。生物有機肥料能明顯改善根際土壤微生物環境,顯著提高土壤酶活性[8]。連年集中施用生物有機肥可改善作物根際土壤的理化性狀,增強土壤生物活性,達到改良土壤、提高土壤肥力的目的[9]。科學合理地施用生物有機肥是保障生產無污染品質蔬菜的一項重要技術措施。筆者以菜瓜作為栽培作物,通過在新建設施土壤上采取多種培肥措施,研究分析了不同培肥技術措施對菜瓜產量、產值以及對土壤微生物數量的影響。
1 材料和方法
2 結果與分析
2.1 培肥措施對產量和產值的影響
2.2 培肥技術肥料成本分析
不同培肥技術措施,投入成本也不相同,具體統計見表4。按照10號棚不同培肥措施分析,生物復合肥與減半量的糞肥和復合肥結合培肥模式產量較高,比常規施肥節省2 220元·hm-2;根據13號棚不同培肥措施分析,秸稈還田、堆漚糞肥、生物復合肥和配方肥集成措施增產效果十分突出,比常規施肥模式肥料投入成本僅僅高2 400元·hm-2。
2.3 培肥技術對土壤微生物數量的影響
針對堆漚糞肥、商品有機肥、秸稈還田、生物菌肥等不同培肥措施,對土壤細菌、真菌、放線菌總數進行調查分析,具體結果如表5。
根據對新建后種植一茬的土壤微生物總量分析結果,不同的培肥處理細菌和放線菌總數增加明顯,這與有機肥的使用、秸稈還田、土壤剖面性狀的改善及通透性的改善有關。培肥后細菌增加了2~3倍左右,放線菌增加了10倍多。根據不同培肥措施來比較:秸稈還田+堆漚糞肥+生物復合肥+配方肥綜合培肥措施,對土壤微生物數量影響較大。土壤中的微生物種類繁多,數量極大,1 g肥沃土壤中通常含有幾億到幾十億個微生物,貧瘠土壤每g也含有幾百萬至幾千萬個微生物,微生物種類和數量越多,土壤越肥沃。通過培肥的施用,土壤中的微生物成倍的增加,有助于腐殖質、有機質的形成,腐殖質分解,釋放出其中的養分供植物吸收利用。土壤中的真菌有許多能分解纖維素、木質素和果膠等,對自然界物質循環起重要作用[10]。
3 結論
(1) 西青區王穩莊鎮新建設施基地土壤,耕層淺,耕層土壤有機質、全氮、全磷、有效磷含量較低。
(2)針對新建設施,通過在菜瓜上采取施用配方肥、秸稈還田、施用有機肥等培肥措施示范比較,減半量的生物復合肥、堆漚糞肥和復合肥結合培肥模式比常規施肥增產2 430 kg·hm-2、節本增效3 825元·hm-2,秸稈還田+堆漚糞肥+生物復合肥+配方肥集成措施比常規施肥模式增產23 610 kg·hm-2,節本增效15 705元·hm-2。
(3)本試驗培肥后,土壤細菌增加了2~3倍左右,放線菌增加了10倍多,根據不同培肥措施來比較:秸稈+堆漚糞肥+生物復合肥+配方肥集成培肥措施對土壤微生物數量影響較大。但是,值得探討的是,農民對生物有機肥和普通有機肥不認可的原因在于單一生物肥與化肥結合作底肥,效果一般的原因在于新建設施基地土壤質地較差,土壤通透性低,保肥保水與供肥能力差,根據試驗分析可見,新建設施土壤培肥不能單純依賴商品生物肥或有機肥來改善土壤結構,應當適當配合增施一些畜禽糞肥以提高商品有機肥或生物肥效果的發揮[11-12]。
微生物論文:淺析微生物采油技術的發展前景
自從20世紀20年代美國人Beckman提出利用微生物提高原油產量的想法,到50年代礦場試驗成功,美國對生物采油技術的發展做出重大貢獻。50年代末到70年代,此項技術在前蘇聯和東歐一些國家取得了較為顯著的進步。目前,美國和俄羅斯是微生物采油技術的兩大研究陣地,二者都主張將微生物代謝的產物作為驅油劑使用,從而提高石油采收率,但又有所不同。美國側重于培養篩選菌種注入油藏,在實際應用中絕大多數項目都是成功的,并在兩次微生物采油經濟評價中,分別使石油產量增加百分之十三和百分之十九點六。俄羅斯主張利用營養物激活原油本源微生物,大量的礦場試驗表明這種方式效果十分顯著。相較而論我國微生物采油技術起步較晚,60年代,勝利油田曾經開展過微生物采油的相關研究,但后來很可惜因種種原因沒能夠堅持到底而中途夭折。進入90年代后,方呈現出一片繁榮的景象,無論是理論實驗還是實際應用都取得了巨大的進展,總體技術已經接近國際先進水平,呂振山等學者利用聚合酶鏈式反應技術(利用DNA在體外攝氏95度時解旋,55度時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合,再調溫度至72度左右DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈,放大特定的DN段,可看作生物體外的特殊DNA復制)對多種微生物進行基因檢測,并對菌種的油藏適應性、增殖地下運移能力、和增采能力進行了的認證;微生物驅油的數學模型在雷光倫等學者的努力下也初步實現了化和完整化;采油微生物代謝物及其分析研究也取得了可喜的成績,包木太等學者用力甚勤,中國有望后來居上,成為微生物采油技術最為先進的主要國家之一。
微生物采油技術標準
菌種選擇標準。菌種篩選是微生物采油技術的關鍵,菌種選擇的優劣將直接影響到采油效果的實現。目前使用的方式主要有培養基因工程采油菌和篩選自然采油菌兩類。就國內情況來講,早期目標是篩選出能夠適應地層環境的菌種,它們可以提供適當的有機營養物,使微生物的生長代謝產物可以起到驅除地層中殘油的作用就可以。隨著技術的不斷進步,菌種篩選要求亦越來越高,菌種耐溫性得到較大的重視,這是因為耐溫性能越好,其適用的油藏范圍越廣;菌種應耐礦化度,降低營養物成本。油藏環境標準。微生物的正常生長是在一定的環境條件進行的,不同的油層條件需要配置不同的微生物溶液,同樣采用微生物技術也需要滿足特定的油藏環境標準,主要包括溫度、深度、壓力、礦化度、滲透率等,有學者已統計出選擇微生物處理的油層條件,在此列出,以備參考。
未來研究前景
微生物采油技術含量較高,同時也是一門新興的交叉學科。在未來的科學研究中,筆者建議:首先,注重提高采收率的機理研究。微生物采油應用技術正日臻完善,驅油機理方面的研究尚有欠缺,仍有進一步發展的必要。其次,微生物采油數學模型的研究亦有待深入,開發模型軟件,建立系統的微生物與鹽水相互作用研究體系,加強微生物在孔介質中的運動規律研究。再次,加強與其他學科的交叉研究。微生物采油技術涉及到生物、石油、地質、化學等多學科的知識內容,因此,需要有關學科的專家通力合作,共同發展,相互幫助,最終使微生物采油技術的發展得到質的飛躍。(本文作者:張洪林 單位:中油國際阿克糾賓油氣股份公司)
微生物論文:分析微生物燃料電池知識引入高中化學
【關鍵詞】引入,高中,化學,知識,電池,燃料,分析,電子,微生物,傳遞
微生物燃料電池(microbial fuel cell,MFC)是利用微生物的催化反應將化學能直接轉化為電能的裝置,其基本構造與普通燃料電池類似,如圖1所示。微生物燃料電池的陽極通常選用導電性能較好的石墨、碳布和碳紙等材料,陰極則大多使用載鉑碳材料。保持陽極池無氧,陰極池有氧,兩池之間的陽離子半透膜使H+自由通過,氧氣不能通過。連接兩極的外電路中串聯電阻器或其他電子設備[1~3]。
圖1 微生物燃料電池構造示意圖
與傳統燃料電池不同的是,微生物燃料電池的陽極反應是靠微生物催化氧化有機物(底物)而產生電子和質子。電子通過導線傳遞到陰極,質子通過半透膜滲入陰極池。陰極池中,氧氣、質子、電子反應生成水。常用葡萄糖作為底物,反應如下[4]:
陽極反應:C6H12O6+6H2O6CO2+24e-+24H+
陰極反應:6O2+24e-+24H+12H2O
電池反應:C6H12O6+6O26CO2+6H2O
2 微生物燃料電池的產電機制
微生物燃料電池的產電過程可分解為5個步驟:(1)底物生物氧化:陽極池中,底物在微生物作用下被氧化,產生電子、質子及代謝產物;(2)產生的電子從微生物細胞傳遞至陽極表面;(3)電子經外電路傳輸至陰極;(4)產生的質子穿過半透膜,從陽極池遷移至陰極池,到達陰極表面;(5)陰極池中,電子受體(如氧氣等)與遷移來的質子和電子在陰極表面發生還原反應。通常,前2個步驟是限速步驟,即電子的產生與傳遞效率是影響MFC輸出功率的最重要因素[2,5]。
2.1 底物生物氧化
2.1.1 產電呼吸代謝[5,6]
微生物在無氧的陽極池中會發生產電呼吸代謝,即通過呼吸代謝過程產生電子、質子及代謝產物。微生物的代謝途徑決定電子與質子的流量,它與底物有關,而陽極電勢也對它起著決定性作用。
陽極電勢較高時,微生物經呼吸鏈進行代謝,電子和質子通過NADH還原酶、輔酶Q及細胞色素進行傳遞;陽極電勢較低,且存在硫酸鹽等其他電子受體時,電子會在這些電子受體上累積,而不與陽極反應;當不存在硫酸鹽、硝酸鹽和其他電子受體時,微生物主要進行發酵,代謝過程也會釋放少量電能,同時醋酸等發酵產物可被某些微生物繼續代謝,釋放電子。
2.1.2 陽極微生物
陽極微生物的種類決定陽極的電子傳遞方式,如表1所示。理論上各種微生物均可用于MFC,但由于細胞壁中的肽鍵等不良導體的阻礙,大多數微生物產生的電子不能傳出體外,因而不具有直接的電化學活性。通常采用添加可溶性氧化還原介體作為電子傳遞中間體的方法,實現電子由細胞內傳遞至陽極表面。此類MFC稱為間接MFC(或有介體MFC),其工業化應用由于介體大多有毒、易流失、價格較高而受到很大阻礙[2,7]。
微生物通過代謝活動能產生一些自身生長和繁殖所必需的物質,如氨基酸、核苷酸等,這些物質稱為微生物的初級代謝產物。一些微生物能以產生的H2、H2S等初級代謝產物作為氧化還原介體,例如Harbermann等設計出利用Desulfovibrio desulfurcan菌種生成的硫化物作為介體的微生物燃料電池。該系統不經任何維護連續可運行5年,其電池反應如下[1]:
2+2H2O2CO2+8H++8e-
代表有機燃料
SO2-4+8H++8e-S2-+4H2O
陽極反應:S2-+4H2OSO2-4+8H++8e-或8/3S2-+4H2O4/3S2O2-3+8H++8e-
陰極反應:2O2+8H++8e-4H2O
有一些微生物(如綠膿桿菌)自身能生成易還原的次級代謝產物,影響電子傳遞。次級代謝產物指以初級代謝產物為前體合成的,對微生物的生命活動無明確功能的物質。
近年來,研究者發現了多種不需介體就可將代謝產生的電子通過細胞膜直接傳遞到電極表面的微生物——產電微生物。此類微生物以位于細胞膜上的細胞色素或自身分泌的醌類物質作為電子載體,將電子由細胞內傳遞至電極上,這種MFC稱為直接MFC(或無介體MFC)。
2.2 陽極還原[2,8]
陽極還原指電子由微生物細胞內傳遞至陽極表面,是電池產電的關鍵步驟,也是制約產電性能的主要因素之一。常見的陽極電子傳遞方式主要有4種:直接接觸傳遞、納米導線輔助遠距離傳遞、電子穿梭傳遞和初級代謝產物原位氧化傳遞。前2種屬于生物膜機制,后2種屬于電子穿梭機制。2種機制可能同時存在,協同作用,促進產電過程。
A直接接觸 B納米導線 C氧化還原介體D還原態初級代謝產物原位氧化
圖2 微生物燃料電池陽極電子傳遞機制示意圖
2.2.1 生物膜產電機制
生物膜產電機制指微生物在電極表面聚集形成膜,通過直接接觸或納米導線輔助作用而轉移電子。這是一種無介體電子傳遞機制。
直接接觸傳遞指與陽極表面接觸的產電微生物菌體可通過細胞膜外側的C型細胞色素,將呼吸鏈中電子的直接傳遞至電極表面,如圖2A所示。該方式只是緊靠電極表面的一單層微生物可傳遞電子給電極,因此電池性能受限于電極表面這一單層微生物的較大細菌濃度。
近期研究表明,某些細菌的細胞表面存在一種可導電的納米級纖毛或菌毛,起到電子導管的作用,依靠這些納米導線輔助,可進行遠距離電子傳遞。這些表面纖毛的一端與細胞外膜相連,另一端與電極表面直接接觸,將細胞外膜上的電子傳遞至電極表面,實現電子轉移,如圖2B所示。這些菌毛可使電子傳遞到離細胞表面更遠處,進行較遠距離的電子傳遞,從而可形成較厚的具有產電活性的生物膜,提高電池性能。
2.2.2 電子穿梭產電機制
電子穿梭產電機制指微生物利用外加或自身分泌的電子穿梭體(氧化還原介體),將代謝產生的電子轉移至電極表面。根據介體的不同,有介體電子傳遞可分外源介體的有介體電子傳遞、還原態初級代謝產物原位氧化傳遞、微生物次級代謝物為介體的電子傳遞。
外源介體的有介體電子傳遞過程如圖2C所示。底物在微生物作用下被氧化,進入微生物細胞內并處于氧化態的介體捕獲釋放出的電子而被還原,處于還原態的介體被微生物排泄出體外,在陽極表面失去電子被氧化,從而將電子傳遞到電極上。
自身可分泌具有電子傳遞功能的氧化還原介體的微生物,主要將代謝物作為介體來進行電子傳遞。其中,以次級代謝物為介體進行電子傳遞的MFC,消除了添加外源介體帶來的各種問題,引起特別關注,其傳遞過程也可用圖2C表示。在微生物體內分泌產生的氧化態次級代謝物作為可逆的末端電子受體,將電子傳遞至細胞外,在陽極表面發生電子轉移,還原態介體重新被氧化,進入下一氧化還原過程。另有一些微生物能以代謝過程中產生的如H2、H2S等初級代謝產物作為氧化還原介體進行電子傳遞,如圖2D所示。作為陽極氧化的還原劑,初級代謝物介體需要滿足一些條件,即氧化還原電勢應較低,但不能低于底物的氧化電勢,且在MFC中易于電化學氧化。
微生物論文:對環境工程微生物實驗教學改革的探索
環境工程微生物學是環境工程專業學生必修的專業基礎課程,是一門實踐性很強的應用學科。實驗課是環境工程微生物教學的重要組成部分,它是培養和訓練學生的實驗操作能力、獨立分析問題、解決問題能力的重要環節。環境微生物的一些基本技術如無菌操作、培養基制備、消毒與滅菌、微生物的培養分離計數等在環境污染處理的應用領域中應用十分廣泛。隨著生物工程技術的發展,現代生物技術如基因重組、PCR技術也在環境工程得到應用。近年來我國高等教育規模急劇擴張,教學實踐資源日趨緊張。如何改革環境工程微生物學實驗的內容及授課方式,一直是大學環境類課程建設的重要內容。近年來,我們對環境工程微生物的實驗教學進行了改革探索,目的是進一步提高環境工程微生物學實驗教學效率,培養具備理論知識扎實、動手能力強的大學畢業生。
1?改革實驗課程的設置
我們將過去獨立、互不相關的微生物實驗改為一連續的探索性的大實驗,開設了一門“環境工程微生物綜合訓練”的獨立課程。課程放置在學期結束時的實踐周中進行,集中對學生進行微生物的培養、分離、鑒定和污水處理應用的基本操作的訓練過程,這樣強化了對學生基本技能和動手能力的培養。綜合訓練的主要內容包括:首先在制備各類培養的基礎上,采取不同的環境樣品中進行接種、培養,通過菌落和個體形態觀察,純化細菌、放線菌或霉菌和酵母菌,然后學生以自己分離、純化的菌種為材料繼續進行以后的實驗,在對細菌形態觀察、革蘭氏染色和菌體大小測定基礎上,做細菌的生理生化試驗,對細菌做出初步鑒定,并將分離出來的細菌用于生活污水的處理上。環境工程微生物綜合訓練的主要實驗內容和所涉及的知識點見表1。改革后的綜合訓練使原來孤立、不連續的實驗形成一個連續的整體。在微生物的菌種的培養和分離,純種的計數和鑒定等方面強化了學生的實驗技能。各種基本操作技能在微生物綜合訓練中多次操作,反復應用,能大大提高學生的微生物技能的綜合應用能力。
驗證操作性實驗相對較多,設計性、綜合性實驗相對較少是目前實驗課程教學中的突出問題,這對培養實用型人才極為不利,也不利于調動學生的學習興趣和積極性。我們將一些應用性、綜合性和學生感興趣的實驗課題,作為選作實驗,供感興趣的學生通過查閱相關資料,綜合運用不同實驗技術,設計實驗方案,通過教師指導和小組討論確定方案并加以實施。實驗后綜合分析實驗結果,撰寫科創論文。比如,“微生物誘導腐蝕”的選作實驗,主要是研究研究厭氧微生物對金屬腐蝕過程,使同學們擴大對微生物環境作用的了解,增強學生的學習興趣和實踐動手能力。這樣,既能提高學生對實驗的興趣,又能促使他們將所學的理論知識應用起來,從而加深對環境工程微生物課堂教學內容的理解。(如表1)
2?重視視頻實驗教學的應用
微生物個體微小,學生對它的感性認識不多,這使得許多有關微生物的概念變得抽象、難以理解。在實驗教學中,有目的的引入了視頻實驗等多媒體教學的方法,可以增加實驗教學的直觀性和趣味性,并在一定程度上彌補實驗教學經費緊張等問題。我們不僅制作了環境工程微生物的多媒體課件,而且采用視頻教學短片,向學生展示基本的實驗操作,以及相關實驗技術的發展及其在生產或科研中的應用。這些改革以視頻的形式向學生展示實驗的基本過程,具有較強的直觀性,通過屏幕清晰形象地展現每一個步驟,使學生掌握實驗操作技能的關鍵所在加深了學生對使微生物的實驗規程和操作技巧理解,如無菌操作技術、微生物的分離和培養技術、消毒滅菌技術、斜面、液體、平板接種培養方法等。采用多媒體進行實驗教學,具有形象、生動、信息量大的優點,結合教師在實驗過程中的講授和示范,有利于學生在腦海里建立每一種實驗操作的標準和規范。因此應該加強多媒體在環境微生物學實驗教學中的應用。
3?強調實驗前的準備工作
傳統的實驗課程教學方法是由實驗教師幫助學生完成很大一部分準備工作,學生只是按教師的講解和實驗手冊的步驟進行操作。我們在微生物綜合訓練中,改變實驗課中講解過多的現象,只是重點講述實驗成功的關鍵并事先提出思考題,讓學生們帶著問題去進行實驗,讓學生通過實驗歸納出結論,從而理解和驗證微生物學的基本原理。教師在實驗中起指導作用,著重培養學生的動手能力。由于綜合實驗涉及的內容很多,所以我們要求學生先復習以前學過的知識并寫出實驗計劃(包括實驗目的、原理、儀器、材料、步驟),然后在課堂上對實驗計劃進行討論,討論后學生再進行修改,由教師審定。審定合格后,學生方可開始進行實驗,這是可以提高學生的實驗培訓的主動性。實驗從實驗材料的準備到每一步實驗都由學生自己動手,教師只起檢查和輔導示范作用。讓學生明白每個實驗步驟操作的好壞對后續實驗的進行有直接的影響,培養學生整體的實驗觀念和細心的操作習慣。由于是學生自己進行實驗的準備工作,可以加深對實驗的目的、原理、方法、步驟的了解,實驗效果很好。
4?改革實驗課程的考核形式
綜合訓練的考核是既是課程設置的要求,也是對學生實驗技能學習的一種督促和檢查。在微生物綜合訓練中,我們將學生4~5人分為一小組,同一組的每位學生既有分工又有合作,每位學生都獨立進行無菌操作、接種培養等工作。在材料的準備和實驗完成的整個過程中,任何一個步驟的失誤都將直接影響最終結果,因此我們要求每位學生規范操作,仔細觀察,及時記錄,培養嚴謹的科學態度和獨立操作能力,老師對每位學生的操作和實驗結果都做出客觀的評價。將綜合訓練考核分為預習 、操作、實驗報告三部分記分。在實驗過程中,進行現場指導,當場考核,不僅要看實驗報告,更要依據預習、現場實驗操作和實驗結果綜合考核。在操作考核中既有單獨的個人操作考核,也有分組的操作考核。實驗報告要實事求是,嚴格杜絕相互抄襲現象。要求學生在實驗報告中對實驗過程和結果進行詳細記錄和分析,養成一個善于分析問題和總結問題的好習慣。實驗報告中的分析與討論是很重要的內容,我們鼓勵學生在分析討論中自由地寫出自己對實驗的理解,比如哪些操作步驟沒有做好,或者在實驗過程中容易出現什么問題,如何避免等,還可以提出對實驗設計修改的建議。通過對實驗問題和結果的分析、討論,可加強學生對理論知識的理解,大大提高學生分析問題和解決問題的能力。
通過這些改革措施,使學生能夠認識到實驗課的重要性,同時也提高了實驗課的地位和學生的積極性,教學質量有較大的提高,為環境工程專業后續課程教學的展開和將來畢業論文的順利完成打下基礎。
5?培養工程實踐觀念
我校是具有電力特色的地方性高等學校,環境工程專業是從電廠化學專業基礎上衍生和發展起來的。我校環境工程專業的課程設置強調重工程、重實踐的專業特色。環境工程微生物學需培養學生分析和解決環境工程問題的思維模式,要使學生了解微生物在環境污染物治理中的作用原理,而不是僅僅停留在微生物學本身基本的實驗操作上。我們在微生物綜合訓練課程設計中特別注意結合工程應用問題,充分圍繞教學隊伍的科研課題及實習單位的生產展開,注重培養學生的工程實踐能力。我們根據本專業教師承擔的科研項目,通過課題的形式,組織一些對環境工程微生物感興趣的學生,參加到教師的科研項目中。一些老師在設計新的污水處理工藝時,經常會有很多項目指標需要測試,只要合適,我們也將樣品拿來讓學生在實驗教學中做。這樣就培養了學生從工程角度思考和解決實際問題的能力。
我們學校毗鄰上海東區污水處理廠,上海東區污水處理廠是亞洲建造最早的污水處理廠,也是目前我國的仍在穩定運行的建于20世紀20年代的污水處理廠,采用活性污泥法的二級生化處理工藝,其基本原理和設計思路已經成為當今城市污水處理的理論經典和工藝核心。上海現有十余座污水處理廠的處理工藝均是在此基礎上的調整或演化。我們組織學生在上海東區污水廠實習,并對不同運行工況下的微生物進行監控,使學生們掌握實際工作中所涉及的微生物的知識和測試技術,深刻了解污水處理工程應用過程中微生物的作用。
總之,這些改革探索,主要的目的是增加學生實驗的主動性,培養學生積極思考的習慣,將一些操作性實驗結合在探究性訓練中去,提高了綜合運用知識、分析和解決問題的能力,培養了嚴謹、鉆研、科學的學風。這也對教師提出了新的要求,也就是不斷開發新的探究性實驗課題,滿足對學生實踐和動手能力的培養,適應環境工程微生物課堂教學發展的要求。
微生物論文:簡述微生物學雙語教學的實踐與思考
論文關鍵詞：微生物學 雙語教學 實踐
論文摘要：微生物學是高等學校生物類專業的重要基礎課程之一，學好微生物學將為進一步學習其他專業課程奠定堅實的微生物學基礎。微生物學科發展日新月異，為使學生跟蹤發展前沿，提升學生對英文的使用能力和綜合素質，高等院校應推行微生物學雙語教學，并應加強在教學體制改革、條件建設等方面的工作。
微生物學是高等院校生物類專業的重要基礎課程之一，學習好微生物學將為進一步學習其他專業課程奠定堅實的微生物學基礎[1]。微生物學科發展日新月異，為使學生跟蹤學科發展前沿，提升學生對英文的使用能力和綜合素質，我們從2004年開始進行微生物學雙語教學的嘗試，取得了較好的效果，并獲得了一些有益的啟示。
一、微生物學的雙語教學實踐
1.關于教學大綱和教學內容
本課程總學時為54學時，其中理論課36學時，實驗課18學時。本課程為雙語教學課程，旨在為學生打下牢固微生物學基礎，培養學生使用專業英語的能力，為學生閱讀英文文獻和進行學術交流奠定良好的語言基礎。課程內容包括微生物形態、生理、生長、遺傳變異、生態以及微生物與自然界物質循環關系5個方面。在內容的選取方面，以周德慶主編的《微生物學教程》（第二版，高等教育出版社，2001年）為基礎，結合J. Nickllin等主編的Microbiology（影印版，科學出版社，2003年）以及筆者留學加拿大麥吉爾大學帶回的該校微生物學講義內容，既照顧到國內微生物學教學的傳統體系，也同時吸納了國外同類課程的長處。
2.教材的選用
2004年實施雙語教學之初，由于沒有合適的教材，為了應急，以J. Nickllin等主編的Microbiology為教材，但是該教材的內容和教學體系畢竟與我們現行的體系存在差異，因此，教材的使用效率比較低較，只有部分章節被利用。另外，原版教材價格較高，加重了學生經濟負擔。針對這種情況，我們于2005年著手自編微生物學雙語教學教材，該教材的特點是吸收了國外同類教材的優點，緊緊結合教學內容，與教學進度同步，重點突出，條理清晰。另外，我們將教學內容和課堂筆記融入教材，使教材同時起到教學參考書和筆記的作用，學生在課堂上可以“以劃代記”，省去記筆記的時間，集中精力去理解和掌握教學內容。與該教材配套的參考書有周德慶主編的《微生物學教程》和J. Nickllin等主編的Microbiology。
3.關于課堂教學
授課之前布置預習作業，督促學生對授課內容和專業詞匯提前預習，做到心中有數，有針對性地去聽課。課堂教學語言的使用根據學生的理解狀況隨機調整，一般課程開始階段英文使用頻率低，隨著學生理解能力的增強，逐步增加英文的量，減少漢語的量，在內容淺顯易懂的章節，則全部采用英文。全部課程采用多媒體授課，多媒體內容絕大部分是英文，在多媒體制作時，盡可能多地采用表格、圖片、動畫等手段，將抽象的教學內容生動化、直觀化，幫助學生理解授課內容。同時多媒體課件上載到校園網，學生可以隨時隨地上網查看學習。一般，在用外語授課以前，用漢語將授課內容梗概做以簡單描述，使學生在基本理解專業知識原理的前提下再花大氣力用外語授課，這樣會起到事半功倍的效果。針對教學內容和專業詞匯布置課后作業，結合課下答疑和輔導，學生可以基本消化和掌握授課內容。
4.關于雙語教學研究
在我國高等院校雙語教學還是一個新鮮事物，在雙語教學的實踐中必然面臨許多困難，需要我們抱著一個探索和研究的態度去實踐，不斷發現問題、解決問題、積累經驗、創新發展。因此，有必要對高等教學中雙語教學的規律進行專門的研究。筆者結合自身雙語教學的實踐先后主持了4項雙語教學項目的研究和建設任務，通過教學項目的開展，提升了自身的理論水平和教學水平，起到了教學研究和教學實踐相互促進、相互支撐的作用。
二、高校雙語教學存在的問題與思考
1.對雙語教學的認識上的誤區。
目前，雖然我國高等院校中多數開設了雙語教學課程，但在高校中也存在對雙語教學的重要意義認識不足的現象。主要表現為，針對雙語教學的鼓勵性政策較少、對雙語教學的投入遠小于實際需求，與雙語教學相配套的改革措施少、雙語教師的培訓力度不夠等。國內外的經驗告訴我們，雙語教學是讓學生精通掌握外語的有效途徑，要想徹底打破我國外語教育中“投入多、產出少”以及“高分低能”的尷尬僵局，雙語教學無疑是一條可以借鑒的成功之路，雙語教學對于中國高等教育的重要意義毋庸置疑，我們必須在這一點上統一認識，堅定不移地推動雙語教學的進程。當然，我們也應該充分認識到雙語教學事業的艱巨性和長期性，認識到雙語教學是一項系統工程，需要社會各方面的共同努力才能完成。我們應避免盲目樂觀和急于求成的思想，要腳踏實地地推進工作，充分預料到可能遇到的困難和挫折，直至取得成效。
2.雙語教學與現行教育體制在一些方面存在沖突。
雙語教學與現行外語教學的沖突。在高校教學計劃中，雙語教學科目所占的學時數一般與該科目正常學時數一致，由于學時的限制，雙語教學很難達到“制造語言環境、用外語熏染學生”的教學效果，常導致教學效果不盡人意。而如果大規模開設雙語課程，在強調雙語教學的同時，勢必會在學時分配、成績考核方式等方面與常規的外語教學產生沖突，因此，我們應該協調兩者關系，考慮適當擴大雙語課程范圍并增加學時[2]。
學生外語水平與雙語教學的沖突。目前，我國高校學生英語的聽說能力普遍較差，多數學生應付日常的外語會話尚有很大困難，更不用說去難理解雙語講授的學科理論知識。我們應該采取一些靈活機動的方式去實施雙語教學，比如，可以采取分類教學。根據學生的外語水平將學生分成不同的班級，對外語聽說能力較強的學生實施雙語教育。而對于外語基礎差、不能適應雙語教育的學生不宜勉強，應對其實施普通的母語教育[3]。
硬件條件不足與雙語教學的沖突。我國高校中的各種教學設施和教學條件都是為開展漢語教學而設置的，而開展雙語教學所需要的教材、參考資料、音像資料、教具等條件幾乎很少有現成的，開展雙語教學的教師必須自己創造條件，開出一門雙語教學課程教師所付出的勞動遠超出一般漢語課程。
微生物論文:現代臨床微生物學在感染控制中的作用
【關鍵詞】 微生物學 感染控制 作用
現代臨床微生物學是一門由臨床醫學、基礎醫學和預防醫學相結合的交叉學科，又是檢驗醫學中重要和成熟的專業之一。這門新興的學科需要微生物醫師和實驗技術人員聯合進行工作，具體任務有四項：①對微生物標本做出快速、的檢驗報告，及時滿足臨床的需要；②進行有關抗菌藥物耐藥性方面的各種試驗，受理抗菌藥物合理應用的咨詢；③密切結合臨床，與臨床醫師討論、研究及處理有關感染性疾病的問題；④參與抗菌藥物臨床合理應用的管理和醫院感染監測、控制和管理［1］。這就要求臨床微生物工作者不僅要完成實驗室工作，還要完成有關的臨床工作，成為感染控制和抗菌藥物臨床應用的參謀和顧問。
1 病原學診斷
1.1 病原學診斷的基本要求
1.1.1 確保臨床標本:恰當的標本采集是感染性疾病診斷的最為重要的一個步驟。要求臨床醫師正確采集能代表感染部位的臨床標本，廣泛采用保護性試子、合格的容器及安全運送培養基，避免標本中的微生物受毒性物質作用而死亡。
1.1.2 了解機體的正常菌群：了解人體的正常菌群是細菌檢驗的必要前提，要了解正常菌群的概念、分布和種類，條件致病菌與內源性感染、菌群失調癥與二重感染的概念，既不要將所有標本分離出來的細菌都當成致病菌，也不能將正常寄居菌所導致的內源性感染輕易放過。
1.1.3 三定一結合：分離鑒定時要做定性、定量和定位分析，并結合病情。要求根據臨床和標本的具體情況確定檢驗程序，選擇培養基及合適的鑒定試驗。要判斷分離出的細菌是致病菌、條件致病菌、還是非致病菌（定性），同時要有一個細菌數量的大致估計，必要時進行半定量和定量培養。在人體有菌部位分離的細菌，其意義大小要參考微生物的定性和定量分析作出判斷；如在無菌部位（如血液、腦脊液）分離出細菌，無論是何種微生物和數量多少，均具有重要意義（定位分析）。在進行“三定”分析時，一定要結合病情，觀察是否與病情相符。
1.1.4 提供快速、的病原學診斷：在臨床醫師提供病人的臨床診斷信息和適當的臨床標本，并盡可能獲得流行病學資料的情況下，進行微生物檢驗和藥敏試驗，要求及時、地分析檢驗結果，為臨床提供的病原學診斷以便對病人作出恰當的處理。盡管目前微生物的分離鑒定仍作為病原學檢測的金標準，但這種“以活菌生長”為基礎的傳統的細菌學鑒定方法速度較慢，不能適應臨床的需要，要求以標本的直接檢查為基礎，如形態、染色、抗原檢測及核酸檢測（核酸雜交、PCR和16SrRNA分析），檢測致病基因（致病島、毒力島）和耐藥基因。盡可能在快速診斷方面下工夫。
1.1.5 及時報告：要使實驗室數據有效地轉化為臨床有用的信息，病原微生物診斷報告應實行三段報告制度，即在涂片或培養陽性結果出現時、敏感試驗結果出來時以及最終結果出來后都要及時報告。
1.1.6 加強質量控制，增加檢驗項目：臨床微生物室必須加強質量控制，保障各種標本的檢驗質量，為臨床提供依據，并滿足臨床需要的各種檢驗項目。當前臨床微生物實驗室應根據本單位的實際情況增加檢驗項目，臨床要求關注的一些項目有：①呼吸道標本的細菌學篩選和半定量培養方法；②呼吸道非典型病原體的檢測，包括衣原體、支原體和軍團菌；③非結核分枝桿菌的培養和藥敏；④免疫抑制或器官移植患者特殊病原體的檢測，如巨細胞病毒，卡氏肺孢子菌等；⑤抗生素相關腹瀉的病原體（主要是艱難梭菌）的檢測；⑥侵襲性真菌的快速檢測和藥敏試驗等。
2 密切聯系臨床，參與臨床會診和感染病例討論會
2.1 獲取臨床信息，做出及時、的微生物報告：臨床感染性疾病往往涉及多種病原體，沒有任何一個單一的試驗能夠檢出所有潛在病原體。因此，臨床信息是選擇試驗方法的重要參考依據。臨床醫師在開化驗單時應寫明有關病人的推測性診斷，以便實驗人員能據此選擇合理的檢驗程序和試驗方法，并能指導臨床正確采集恰當的標本；當實驗室開始有實驗結果時，必須及時通知臨床醫師，以便讓他們重新評價診療方案。
2.2 疑難微生物報告的解釋與咨詢：近年來，不少感染性疾病特別是醫院感染的病原譜和藥敏譜發生很大變化。以往罕見的微生物頻頻出現在檢驗報告單上，藥敏試驗的方法、受試品種、結果解釋也有不少改變。臨床醫師常常難以正確理解和利用臨床微生物檢驗資料。面對這一現狀，臨床微生物室應積極與臨床溝通，幫助解決臨床醫師在判斷微生物檢驗和藥敏結果報告單時的困難。指出正常菌群、污染菌和感染菌的鑒別與判斷少見菌或罕見菌的意義；培養陰性時的可能原因；藥敏試驗結果的判斷標準和局限性；特殊耐藥細菌的耐藥特點等，必要時在報告上增加注解。
2.3 設置微生物醫師，作為臨床與微生物室溝通的橋梁：目前國外不少醫院均有臨床微生物專家或檢驗醫師的會診、咨詢制度［2］。如檢驗開始時發現圖涂片有問題，即由檢驗醫師主動與臨床聯系，共同討論涂片所見的意義。每天微生物室的醫師與技師在一起看培養和藥敏結果，尤其是痰培養結果要與直接涂片核對，發現問題及時與病房聯系。建議臨床微生物室每日有一位醫師參加本院感染科、呼吸科或ICU的晨會，并回來向科內醫師匯報有關感染病人情況。或定期派出醫師帶上有關檢驗結果，參加一些臨床科室的感染問題討論會，具體解決感染癥的治療問題［3］。如定時參加ICU、腫瘤科、神經外科、兒科等的討論會，對血培養陽性、腦脊液檢查陽性或嚴重燒傷感染的病人，微生物醫師要主動去病房看望，參加治療方案討論。對菌血癥或膿毒血癥病人要協助找出原發癥灶。臨床微生物醫師巡視病人后要在病歷上記錄意見，必要時可與臨床的主管醫師、主任一起討論。各臨床科室如有感染問題可與臨床微生物室聯系，詢問檢驗報告的意義或要求會診。微生物室每周召開一次感染病例討論會，討論感染病人的情況，交流發現的問題，并將臨床微生物室的意見與臨床科室進行交流。微生物室醫師也要參與日常檢驗工作，并接受臨床有關微生物學問題。
3 參與抗菌藥物臨床應用的管理
合理應用抗菌藥物，減少或避免耐藥菌株產生，是當前抗感染領域的一大難題，臨床微生物室在抗生素合理使用中起重要作用［4］。首先要重視感染的病原學診斷。臨床醫師在使用抗菌藥物前，應采集多份微生物學標本做細菌培養和藥敏試驗，微生物室則為臨床提供快速、的細菌檢驗和藥敏結果。此外，微生物專家與臨床醫生密切聯系并參與患者的治療也是控制抗生素用量的重要方法。微生物專家應參與醫院藥事委員會，參與制定抗生素使用指南、教育和培訓、監督和檢查等。這方面香港馬麗醫院的做法是由感染監控護士負責走訪感染病例，發現抗菌藥物誤用或不合理應用時，由微生物室主任出面向院長、當事科室主任和當事人反饋，取得較好效果。
4 參與醫院感染的監測、控制和管理
我國《醫院感染管理規范》明確指出檢驗科在醫院感染管理中應履行以下職責：負責醫院感染常規微生物學的監測；開展醫院感染病原微生物的培養、分離鑒定、藥敏試驗及特殊病原體的耐藥性監測，定期總結、分析向有關部門反饋，向全院公布；醫院感染流行或暴發時，承擔相關檢測工作。
臨床微生物實驗室在醫院感染的監測、控制和管理中的作用包括：①加強病原學監測，作為判定醫院感染的基礎；②加強耐藥性監測，以指導合理使用抗菌素；③加強環境、器械等微生物學調查，以達到衛生學指標要求；④保障醫院內消毒、滅菌的質量；⑤通過流行病學調查和細菌學分型試驗，追蹤感染源并加以控制［5］。
4.1 加強監測：臨床微生物室是醫院感染控制委員會的必然成員，微生物檢驗在醫院感染的監測中起重要作用。若在臨床微生物檢驗中發現有醫院感染問題，要及時與醫院感染控制部門、病房醫師和護士聯系，并注意發展動態。醫院感染中的一些特殊耐藥菌如GRE、MRSA、產ESBL腸桿菌科細菌等常通過交叉感染傳播，曲霉菌、軍團菌等常在空調、供水系統、霧化裝置存在并導致感染，對可能攜帶這些致病菌的來源常規監測并提醒臨床注意，通常可有效預防傳播擴散并節省大量抗感染費用［6，7］。
4.2 醫院感染的教育和培訓：臨床微生物室要參與有關人員的醫院感染教育和培訓工作。如講解臨床微生物標本的采集、保存、運送的要求和注意事項，對標本采集前要求病人應該做些什么準備，采集標本應選擇什么時機、什么部位，每天采幾次、采多少量以及采樣部位應該如何消毒等一系列問題進行解釋；對人體常見的正常菌群、定植菌、污染菌和感染菌等內容進行培訓；對各種細菌耐藥酶的檢測及其含義和在選用抗生素方面的意義與臨床進行經常性的溝通等等。可采用多種方法如講座、討論會、簡訊、墻報園地甚至參與查房等形式。也可以融合到醫院感染管理的繼續教育培訓項目之中。
4.3 參與消毒隔離的管理：正確、科學地實施消毒與隔離技術對預防和控制醫院感染非常重要，正確地指導、監查消毒隔離工作也是臨床微生物室的工作之一。當發生醫院感染暴發流行或特殊耐藥細菌感染時，臨床微生物專業人員應參與制定消毒隔離措施，對相關的人員管理、廢棄物的處理等環節提出微生物專業意見。
4.4 定期細菌耐藥性監測結果：目前對許多感染性疾病的抗菌藥物選擇是經驗性的。但經驗用藥也需要循證醫學和流行病學資料的支持。建議將所有病原菌分離和藥敏的資料用WHONET軟件保存，定期細菌耐藥性監測結果，隨時統計分析ICU等重點科室常見病原菌和耐藥狀況，對臨床經驗性選擇抗生素、提高重癥感染的救治成功率大有幫助。
4.5 通過分子分型技術控制醫院感染：常用的分子分型技術有PFGE、RAPD等。微生物實驗室設置分子分型實驗室，對及時發現和控制病原菌流行具有重大的意義。國外一些醫院的做法是對VRE等不常見的耐藥菌一經發現即進行分子分型，根據基因分型，判斷流行的可能性及范圍并采取相應措施控制感染［8］。如某醫院對2個月時間內自16個病人分離出的19株VRE進行分型，結果顯示其中十四株為一個型別，其他為一個型別，高度提示VRE流行，經調查分析，發現14名患者中11人有直接聯系。根據這些分析，采取了針對控制措施而中止了感染［9］。另一些醫院針對肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、粘質沙雷菌等感染流行問題，均通過分子分型而得到控制。據統計，微生物室成立分子分型實驗室（設備及人員）的費用為18,050美元，每年分子分型相關支出為400，000，美元，假設所有醫院（美國）都常規進行分子分型，實驗相關費用達20億美元，但節省下來的治療醫院感染的費用將超過5倍（100億）。
總之，筆者認為：臨床微生物實驗室在感染控制中發揮作用大小的關鍵：一是要走出實驗室，加強與臨床的聯系；二是要立足本職，做好常規的臨床微生物檢驗工作，努力提高標本的培養陽性率，縮短結果的報告時間，提高檢驗結果與臨床治療結果的符合率；三是要加強宣傳、教育培訓，在醫務人員中普及臨床微生物學知識，并對檢驗的結果作出合理的解釋，協助臨床正確閱讀和分析微生物檢驗報告單，使微生物檢驗結果和資料能及時有效地被臨床醫師所利用。
微生物論文:微生物轉化技術在現代醫藥工業中的應用
【關鍵詞】 微生物轉化技術；,,,,生物催化；,,,,關鍵中間體
摘要： 對微生物轉化技術在現代醫藥工業應用上的獨特優勢，特別是在手性藥物或藥物中間體制備、借助微生物轉化手段實施組合生物催化在新藥篩選方面發揮的積極作用進行了闡述分析，并結合作者自身近年來在該技術領域的實踐和收獲對數個相關課題作了介紹。
關鍵詞： 微生物轉化技術； 生物催化； 關鍵中間體
1 概述
在過去的30多年中，微生物轉化或酶轉化技術在有機化學合成領域中的嘗試不僅使理論研究獲得廣泛開展，在實際應用方面也取得了長足的進步。許多化學合成工藝相當復雜的藥物、食品添加劑、維生素、化妝品和其它一些精細化工產品合成過程中的某些重要反應，目前已經能夠用微生物或酶轉化技術得以替代。在許多國外文獻中經常能夠看到的描述這種技術的名詞有：microbial transformation、microbial conversion、biotransformation、biotransconversion和enzymation等［1，2］。微生物轉化的本質是某種微生物將一種物質(底物)轉化成為另一種物質(產物)的過程，這一過程是由某種微生物產生的一種或幾種特殊的胞外或胞內酶作為生物催化劑進行的一種或幾種化學反應，簡言之，即為一種利用微生物酶或微生物本身的合成技術。這些具有生物催化劑作用的酶大多數對其微生物的生命過程也是必需的，但在微生物轉化過程中，這些酶僅作為生物催化劑用于化學反應。由于微生物產生的這些能夠被用于化學反應的大多數生物催化劑不僅能夠利用自身的底物及其類似物，且有時對外源添加的底物也具有同樣的催化作用，即能催化非天然的反應(unnatural reactions)，因而微生物轉化可以認為是有機化學反應中的一個特殊的分支。某種特殊的微生物能夠將某種特定的底物轉化成為某種特定的產物，其本質是酶的作用。因此，對酶轉化無需多作解釋，它與微生物轉化的差別僅在于：前者是一個單一的酶催化的化學反應，而后者為了實現這一酶催化反應，需要為微生物提供一個能夠生物合成這些酶的條件，因此，從這一角度來看，這似乎是真正的生物轉化。另外，盡管用于生物轉化的酶大多來自于微生物，但也可以是來自于動物和植物的酶。而對于一個具體的生物轉化來說，究竟是采用微生物轉化技術，還是采用酶轉化技術，這要綜合考慮實現這一過程的諸多因素，如成本、環境、技術裝備和質量要求等。在研究一個微生物(或酶)轉化過程時，需要仔細地考慮諸多方面的問題如：所用轉化底物的選擇、所用微生物對不同底物轉化能力的考察、轉化路線或轉化反應的選擇等。其中最主要的是尋找適合于所設計轉化過程的微生物，以及如何來提高這種微生物的轉化能力，即提高這種酶活力。再則是發現一種新的酶或一種新的反應以便為設計一個新的微生物轉化過程提供一條線索。為了尋找能夠適合作為生物催化劑的微生物酶，除了有必要對原來已知的一些重要的酶或反應進行重新評價外，一種更為有效的方法是篩選新的微生物菌株或酶［3～6］。用于微生物轉化的菌株或酶的篩選的范圍應該盡可能地廣，因為至目前為止已經發現了3000余種能夠催化各種化學反應的酶，其中有些酶的催化效果比化學催化劑好；另外，微生物的多樣性和其生理生化特性的多樣性(它們能夠修飾和降解許許多多有機化合物)，使我們有可能找到某種微生物或酶來催化某種特定的和所期望的化學反應。
2 生物轉化與藥物開發的應用
愈來愈多的研究表明，作為治療用藥物的外消旋體混合物有著不可避免的缺點，而美國FDA公布的手性藥物指導原則無疑加快了從頭開始開發單一異構體藥物或利用外消旋體轉換技術從已有的藥物中開發單一異構體藥物的步伐。手性藥物制備的關鍵技術是不對稱合成技術。多年來，有機化學工作者已經研究開發了許多種用化學的方法進行不對稱合成的技術，但近20多年來，很多長期從事化學合成研究的工作者對微生物和酶反應發生了興趣，與此同時，很多長期從事微生物和酶的研究的工作者對如何將此應用于有機合成發生了興趣，從而使生物催化轉化(biocatalytic transformation)成為一種進行不對稱合成的重要技術。應用生物催化轉化技術進行不對稱合成與化學合成法相比較具有的優越性有：1)轉化底物某一基團的專一性強，即對不需要轉化的基團無需保護；2)通過對用于某一轉化的微生物進行菌種選育和轉化條件的優化，可以得到極高的轉化率；3)生物催化轉化的反應條件溫和且對環境的污染很小。特別是近年來DNA重組技術的應用和新的轉化系統的開發應用，使愈來愈多的原來使用化學方法進行不對稱合成的化合物有可能被生物催化轉化的方法來替代［7～10］。利用生物轉化技術進行手性藥物的開發主要進行兩個方面的工作：一是進行藥物關鍵中間體的制備，因為利用生物催化轉化方法制備對映體純化合物(enantiopure compounds)具有很大的吸引力，但試圖利用這種方法來完成所期望的復雜的有機合成往往是困難的，甚至是不可能的，而利用這種方法獲得某一關鍵中間體是切實可行的；另外，盡管用化學的方法能夠在實驗室條件下獲得所需要的手性藥物，但往往是由于成本和技術問題難以實現產業化。因此用化學生物化學的制備路線具有獨特的優越性，即所謂的“綠色合成工藝”；二是進行消旋化合物的生物拆分或轉化，得到單一構型的藥物分子。表1為一些利用生物轉化制備手性藥物或關鍵中間體的實例［11］。
3 組合生物催化與新藥發現組合
生物轉化(催化)(combinatorial biocatalysis)，是指利用一種以上的具有特殊轉化功能的微生物或酶，對同一個母體化合物進行組合轉化，以得到化學結構的多樣性，它是從已知化合物中尋找新型衍生物以及從簡單化合物制備復雜化合物的有效手段。從某種角度講，它比化學合成的方法更為簡單和有效。這是一個新的研究領域。天然產物的多樣性和其結構的復雜性，是存在于生物體內大量酶的作用結果。生物體內負責一系列重要生命活動的酶，在體外同樣具有相同的催化能力。因此，只要體外的催化環境與體內相仿，則能夠實現一系列復雜的，特別是用傳統化學合成方法難以實現的化學反應。利用生物催化劑或化學合成酶催化相結合的方法，能夠大大地增加衍生物的多樣性，以及能夠有效地對復雜天然產物的結果修飾和從簡單的分子構建新的化合物庫，在這過程中，往往能夠發現新的生理活性物質。生物催化劑為擴大組合化學提供了各種合成的可能性［1，11～13］。表2為一些由酶或微生物催化的典型反應。利用生物催化發現先導化合物的優越性在于：1)可能進行反應的范圍廣；2)能夠定向進行區域選擇性和立體選擇性；3)不需基團保護和脫保護，一步實現所需的反應；4)在溫和和均一的條件下可容易地實現自動化和一步反應的重現性；5)溫和的反應條件保障了復雜易變的分子結構的穩定性；6)高的催化活性可以降低催化劑的用量；7)酶的固定化可以使催化劑反復和循環使用；8)生物催化劑可在環境中被降解。
4 近年來本中心開展的一些相關課題的進展
近年來，上海來益生物藥物研究開發中心開始涉及微生物轉化課題的研究，特別是用微生物進行植物甾醇邊鏈降解制備甾體藥物關鍵中間體的開發以及抗糖尿病新藥米格列醇和伏格列波糖的開發。
表1 利用生物轉化制備手性藥物或關鍵中間體的部分實例（略）
4.1 甾體類微生物轉化的研究甾體藥物包括激素類藥物和非激素類藥物：前者如性激素、類皮質激素和蛋白同化激素等；后者有抗細菌和抗腫瘤藥物等。由于其不可取代的用途及治療適應證不斷擴大，甾體藥物越來越引起人們的重視。利用生物轉化技術進行甾體藥物生產主要有植物甾醇的邊鏈切除，以得到關鍵中間體ADD和4AD，以及進行立體選擇性的羥化反應。(1)利用微生物轉化切除邊鏈，制備甾體藥物關鍵中間體ADD和4AD微生物對甾體邊鏈的裂解轉化是一個很慢的過程，因為底物和產物的溶解性都很差，且底物傳遞至細胞的過程和產物傳出細胞的過程都很慢。因此，如何提高底物的溶解性一直是提高微生物轉化率的重要步驟。我們在微生物轉化菌株的菌種選育、轉化條件的優化和轉化系統的研究方面進行了數年的研究工作［14～17］，最終已經獲得了具有產業化價值的微生物轉化技術，即以天然維生素E生產下腳料(含有混合植物甾醇)為底物制備甾體藥物關鍵中間體ADD和4AD的工業化路線。圖1所示為混合植物甾醇底物和ADD以及4AD的化學結構。(2)利用微生物轉化選擇性羥基化，制備甾體藥物關鍵中間體11OHADD、11OH4AD，以及抗心衰新藥依普利酮關鍵中間體11OH坎利酮我們分別進行了以ADD、4AD以及坎利酮為底物的微生物轉化菌株的篩選、選育，以及轉化條件的優化等大量研究工作，最終獲得了具有產業化價值的微生物轉化制備工藝。圖2所示為11OHADD和11OH4AD的化學結構。圖3所示為從坎利酮到11OH坎利酮的微生物轉化。(3)利用微生物轉化技術，獲得多種4AD結構類似物很多甾體藥物的關鍵中間體與4AD的結構類似物有關，我們篩選了多種具有不同特性的微生物菌株對4AD進行轉化，結果得到了一系列的4AD結構類似物，如圖4所示［18］。(4)利用微生物轉化技術，從植物混合甾醇直接生產睪酮在我們多年對植物甾醇微生物轉化邊鏈切除的研究過程中，發現了一個非常有意義的現象：即在經過誘變處理的大量微生物轉化菌種中，發現了一株能夠直接將植物甾醇轉化成睪酮的菌株［19］。同時，轉化條件的改變能夠使睪酮的轉化率大大地提高。進一步的研究表明，能夠將植物甾醇直接轉化成大量睪酮的微生物菌株，其17羰基還原酶的活性比較高，因而將已經轉化的ADD和4AD中17位的羰基還原成為羥基，分別獲得睪酮和去氫睪酮，以及另外一個17位邊鏈發生改變的結構類似物，如圖5所示。經過大量的菌種選育工作和轉化條件的優化工作，已經獲得了一條利用微生物轉化直接從混合植物甾醇制備睪酮的工業化工藝路線。
圖1 底物混合植物甾醇和產物ADD以及4AD的化學結構（略）
圖2 11OHADD和11OH4AD的化學結構（略）
圖3 從坎利酮到11OH坎利酮的微生物轉化（略）
圖4 利用微生物轉化4AD得到的一系列結構類似物（略）
圖5 睪酮和去氫睪酮的化學結構（略）
4.2 降糖藥物米格列醇的研究開發米格列醇(miglitol)的發現源于對微生物發酵產物野尻霉素的研究，研究顯示該原來作為抗沙門氏菌的抗生素具有較強的α葡萄糖苷酶抑制作用，繼而成為及時個具有開發價值的淀粉酶抑制劑。1脫氧野尻霉素(1deoxynojirimycin)由野尻霉素還原而得，也可由多種鏈霉菌和芽孢桿菌產生，同樣具有糖苷酶抑制作用。N取代1脫氧野尻霉素具有更好的降糖效果，米格列醇就是其中之一。米格列醇的結構與葡萄糖相似，能夠可逆地競爭性抑制假單糖α葡糖苷酶，減少單糖的代謝，降低在小腸的吸收。圖6所示為葡萄糖、1脫氧野尻霉素和米格列醇的化學結構。根據文獻報道，有多種制備米格列醇的化學合成工藝。其中有以6脫氧6氨基山梨醇為原料，經雷尼鎳催化還原后，再與環氧乙烷反應而成。也可以先與環氧乙烷反應后，再在鈀碳催化下還原制得。另外，也有多種利用生物轉化和化學合成相結合的方法，以及先用微生物發酵制備野尻霉素或1脫氧野尻霉素后再用化學合成的方法來制備米格列醇［20］。本中心研究開發的米格列醇制備工藝采用生物轉化與化學合成相結合的方法，簡要工藝流程如圖7所示。本制備工藝的關鍵是篩選具有高效氧化氨基葡萄糖的微生物菌株，以及能夠實現產業化的轉化工藝。
4.3 降糖藥物伏格列波糖的研究開發伏格列波糖(voglibose)是新一代的α葡糖苷酶抑制劑，最初是從某種放線菌培養液中發現的氨基糖類似物，口服后能競爭拮抗性地抑制腸道內雙糖類水解酶(α葡糖苷酶)，延緩糖尿病患者餐后血糖的迅速上升從而抑制餐后高血糖。同時伏格列波糖明顯降低身體的脂肪量，肥胖的減輕使胰島素受體敏感性增加，進而使空腹血糖逐漸明顯下降。據文獻報道，伏格列波糖的制備除了通過全化學合成獲得外，還有以下幾條路線：一條路線是由有效霉素產生菌發酵，從發酵液中分離出大組分有效霉素A，經生物轉化后得到關鍵中間體valienamine和validamine，再經過化學合成即可得到終產物；或是從有效霉素發酵液中分離出小組分有效霉素G，生物轉化得到關鍵中間體valienamine和valiolamine，兩者經適當步驟的化學合成反應后即可得到終產物；第二條路線是從有效霉素發酵液中分離出小組分valienamine，經化學合成后得到終產物；第三條路線是從有效霉素發酵液中分離出小組分valiolone，同樣經適當化學合成反應后得到終產物；第四條路線是由D葡萄糖經一系列的化學反應直接合成得到終產物。其流程如圖8所示。本研究中心利用及時條工藝路線，篩選獲得了具有高轉化效率的微生物菌株，以及適合工業化生產的轉化工藝。
圖6 米格列醇、野尻霉素及1脫氧野尻霉素、αD葡萄糖的化學結構（略）
圖7 米格列醇的制備工藝（略）
4.4 N乙酰神經氨酸的研究開發N乙酰神經氨酸(Neu5Ac)是合成抗病毒藥物扎那米韋的前體，其本身也具有多種重要的應用價值。目前有三種不同的生物轉化方法制備Neu5Ac(圖9)：途徑Ⅰ是一個相對簡單的醛縮反應；途徑Ⅱ涉及到反應前體ManNAc的磷酸化；途徑Ⅲ所合成的產物Neu5Ac9P需要進一步用另外的酶脫磷酸化。這些合成方法均可在體外進行，目前已經用于工業化生產的是途徑Ⅰ。
本中心采用途徑Ⅰ的生物轉化方法，首先從E.coliC600中成功地擴增了N乙酰神經氨酸裂合酶基因(nal)，通過同源性比較發現，它與來源于E.coli K12的nal序列一致。氨基酸序列比對結果表明，136和164位的氨基酸也為賴氨酸和酪氨酸，與文獻報道的活性中心位點一致。進而，將該基因通過EcoRI和BamHI兩個酶切位點，嚴格控制起始密碼子和啟動子間距離的情況下克隆到高表達載體pYG5上，構建成新的質粒pLY2，并進行其表達研究。然后對粗酶的制備、轉化條件的優化、分析檢測方法的建立，以及產物的分離純化等進行了研究， 初步獲得了一條適合工業化生產N乙酰神經氨酸的路線。
微生物論文:微生物次級代謝產物生物合成基因簇與藥物創新
【關鍵詞】 ,微生物次級代謝產物；,,生物合成基因簇；,,藥物創新；,,組合生物合成；,,代謝工程
摘要： 微生物產生眾多結構和生物活性多樣的次級代謝產物，其生物合成基因簇的克隆是藥物創新和產量提高的必要前提。迄今為止已有超過150種生物合成基因簇通過各種方式被克隆，并被用于組合生物合成、體外糖類隨機化、代謝工程的定向改造。我們研究室已經克隆并測定了氨基糖苷類井岡霉素/有效霉素、多烯類抗生素FR008/克念菌素、聚醚類南昌霉素、聚酮類梅嶺霉素、雜合聚酮多肽類口惡唑霉素等生物合成基因簇。深入的基因功能分析揭示了他們獨特的生物合成途徑和調節機理，為正在進行的組合生物合成結構改造和代謝工程產量提高奠定了基礎。
關鍵詞： 微生物次級代謝產物； 生物合成基因簇； 藥物創新； 組合生物合成； 代謝工程
微生物產生的次級代謝產物在化學結構和生物活性方面多種多樣，主要的產生菌類群包括放線菌、芽孢桿菌、粘細菌、假單胞菌、藍細菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以上是以鏈霉菌為代表的放線菌產生的。根據結構特點可以基本上將抗生素分為β內酰胺、氨基糖苷、核苷、四環素、多肽、糖肽、大環內酯、安莎、聚醚和類萜等種類。以上多種多樣抗生素的結構特點也決定了它們生物活性的多樣性，除了可以抑菌殺菌外，還可以作為抗癌藥、抗寄生蟲藥、除草劑、酶抑制劑、免疫調節劑、受體拮抗劑、低血膽固醇治療劑等等，在醫療、工業、農牧漁業和環境保護等領域均發揮著重要作用。隨著大量微生物次級代謝產物的分離，從自然界直接分離具有新結構、新活性化合物變得越來越困難，已知結構化合物分離的重復性很高。另一方面，臨床上病原微生物的耐藥性日益嚴重，伴隨著多耐藥性、高耐藥性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不斷出現，如何利用已有資源，定向創造新結構、新活性化合物以及提高微生物次級代謝產物的產量，成為當務之急。分子生物學基礎上的組合生物合成(combinatorial biosynthesis)［1］和代謝工程(metabolic engineering)［2］成為解決上述問題的重要手段，但是次級代謝產物生物合成基因(簇)的克隆與功能鑒定是這兩項技術實施的必要前提。
1 微生物次級代謝產物生物合成基因簇特點及總體研究進展
1.1 微生物次級代謝產物生物合成基因簇的組成特點自從Malpartida等1984年克隆了放線紫紅素的全部生物合成基因［3］，以及隨后克隆的榴菌素［4］、紅霉素［5，6］、泰樂星等生物合成基因，揭示了微生物次級代謝產物生物合成基因成簇排列的特征，即與特定產物合成相關的結構基因、調節基因、耐藥性基因和轉運蛋白等集中位于染色體的一段連續區域。除此之外，微生物次級代謝產物生物合成基因簇還具有以下幾個特點：①生物合成基因一般形成幾個不同的轉錄單位；②通常含有一個以上的耐藥性基因，且耐藥性基因和結構基因表達之間有一定的相互調節；③絕大多數基因表達的調控發生在轉錄水平，除了受特異的途徑專一性調節因子調控外，還受到同時影響胞內其他產物合成甚至細胞分化的全局性調節因子的調控［7］。微生物次級代謝產物生物合成基因的成簇排列特征為相應生物合成基因的克隆提供了方便，也就是說，幾乎任何一個結構基因、耐藥性基因、轉運蛋白基因或途徑專一性調節基因的克隆都有可能導致整個生物合成基因簇的獲得。
1.2 微生物次級代謝產物生物合成基因簇的克隆情況根據微生物次級代謝產物生物合成基因簇的上述特點，大量的生物合成基因簇從不同的微生物種群中克隆出來，其中主要的克隆方法有突變株回補(如放線紫紅素［3］)、利用同源性較高的異源DNA作為探針的雜交法(如榴菌素［4］)、耐藥性基因的克隆(如紅霉素［5］)、從蛋白質分離到反推編碼DNA的反向遺傳(如利福霉素［8］)、根據同源蛋白保守區設計的兼并性引物擴增法(如阿卡波糖［9］)以及整個生物合成基因簇的異源表達(如腸球菌素［10］)等。通過上述克隆方法，迄今為止已經克隆了超過150種微生物次級代謝產物的生物合成基因簇，一方面進一步證明了微生物次級代謝產物成簇排列的特點，另一方面也揭示了結構上不同的代謝產物在編碼基因上的相關性，例如β內酰胺類、多肽類、糖肽類都主要由非核糖體肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)［11］負責合成，四環素類、大環內酯類、安莎類、聚醚類則由I型或II型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)［1］合成。因此根據編碼基因種類的不同，所有已克隆的生物合成基因簇可以按表1中所列的類別來歸類。
1.3 次級代謝產物生物合成基因簇資源的定向利用如此眾多生物合成基因簇的克隆為微生物次級代謝產物的比較研究打下了堅實的基礎。1985年Hopwood等將放線紫紅素的生物合成基因轉入榴菌素和麥德霉素產生菌獲得雜合抗生素［12］，標志著微生物次級代謝產物組合生物合成技術的誕生，即通過將不同次級代謝產物合成基因在微生物間的相互交換產生非天然的基因組合，從而人為定向設計具有新結構的次級代謝產物的遺傳操作過程。迄今為止，組合生物合成的理論基礎和技術儲備已經相當豐富，并且產生了數百種非天然的“天然產物”(nonnatural natural product)。2001年Thorson教授首先提出了將化學合成和酶催化進行有機結合的體外糖類隨機化(in vitro glycorandomization，IVG)［13］的新概念，即把通過化學方法高效合成的多種自由糖基，在定向進化產生的具有底物識別廣譜性糖基激酶、核苷轉移酶和糖基轉移酶的級聯催化下，在體外轉移到多種糖基受體，從而大量產生多種新結構、新活性衍生物的過程。他們利用萬古霉素的糖基轉移酶GtfE和許多非天然的NDP糖基供體一次性獲得了32種攜帶有不同糖基的萬古霉素衍生物，充分顯示了該項技術的高效性和巨大潛力。微生物次級代謝產物完整生物合成基因簇的克隆和功能分析使得生物合成途徑及生物合成調控機理的闡明成為可能，從而揭示生物合成途徑的限速步驟和調控節點，并進行相應的遺傳操作來顯著提高次級代謝產物的產量或提高活性組分的比例、降低消除低活性組分的含量。因此在基因簇克隆和遺傳分析基礎上的代謝工程研究也變得目的性更強、效率更高。例如，Malmberg等在利用棒狀鏈霉菌研究頭霉素C的生物合成過程中發現，控制從初級代謝產物賴氨酸向頭霉素前體α氨基己二酸轉化的賴氨酸ε氨基轉移酶(LAT)是頭霉素C生物合成的限速酶，額外拷貝LAT向棒狀鏈霉菌的引入致使頭孢霉素C的產量提高了2～5倍［14］。
2 上海交通大學分子微生物學實驗室的研究進展
我們實驗室長期從事重要的農業、飼養業抗生素生物合成的研究，包括抗水稻紋枯病的井岡霉素和5102I號素、抗稻瘟病的慶豐霉素、抗玉米小斑病的5102II號素和靜絲霉素、 廣譜抗真菌多抗霉素、 抗雞球蟲病的南昌霉素、廣譜殺蟲活性的梅嶺霉素等。近年來我們也在抗真菌抗生素FR008/克念菌素、抗腫瘤和HIV口惡唑霉素、抗腫瘤安絲霉素的生物合成方面進行了深入研究。
表1 已克隆的微生物次級代謝產物生物合成基因簇（略）
2.1 井岡霉素/5102I的生物合成氨基糖苷類井岡霉素是由吸水鏈霉菌井岡變種5008產生的重要農用抗生素，是我國乃至東南亞防治水稻紋枯病的重要藥物，年產量已經超過4萬噸。井岡霉素和有效霉素(validamycin)的結構一致，即結合有一分子葡萄糖基的井岡胺/有效氧胺(validoxylamine)。井岡霉素的大面積使用使提高其產量(尤其是活性組分A組分的含量)，降低生產成本具有重要的意義。井岡霉素也是生產臨床上重要的治療糖尿病藥物伏格列波糖(vogliobose)和阿卡波糖的重要前體，其產量的提高和特異合成中間體的積累將顯著降低生產成本或簡化生產工藝。井岡霉素和阿卡波糖同屬于C7N氨基環醇類次級代謝產物，前期的化學喂養實驗證實由7磷酸景天庚酮糖環化而成的2表5表有效醇酮是兩者生物合成途徑中共同的前體物，因此推斷催化該步反應的環化酶基因應該有較高同源性［15］。利用來自于游動放線菌SE50/110阿卡波糖生物合成基因簇的環化酶基因acbC為異源探針，我們在井岡變種5008的基因文庫中釣取了覆蓋約70kb染色體區域的陽性克隆，隨后該區域內30kb大片段的缺失導致突變株喪失了合成井岡霉素的能力，直接證明了該區域同井岡霉素的生物合成直接相關［16］。對acbC同源環化酶基因valA兩側45kb區域的序列測定揭示了27個開放閱讀框(open reading frame,ORF)(白林泉等，待發表)，其中包括16個結構基因，2個調節基因，1個轉運蛋白基因，3個與轉座有關的基因，1個抗碲基因和其他4個未知基因(圖1)。通過基因的逐個敲除與回補我們確定了與井岡霉素A組分合成直接相關的8個結構基因(valA, B,C,K,L,M,N,G)，而且這8個基因重新組裝后在變鉛青鏈霉菌1326中的異源表達也產生了井岡胺A和井岡霉素A。同時我們正在通過異源表達各個相關合成酶并進行相關的體外催化活性分析。一方面直接證明了環化酶ValA能夠環化7磷酸景天庚酮糖生成2表5表有效醇酮，另一方面糖基轉移酶ValG催化一分子的葡萄糖轉移到井岡胺上從而生成最終產物井岡霉素A，而且UDP葡萄糖是的糖基供體。而對激酶ValC的體外催化分析發現井岡霉素生物合成的中間產物有效烯酮和有效酮為最適底物， 明顯不同于阿卡泊糖生物合成基因簇種的同源蛋白AcbM的功能，AcbM催化2表5表有效醇酮的磷酸化(章亦榮等，待發表)。井岡霉素生物合成基因簇的克隆、序列測定和初步功能分析為其生物合成途徑的最終闡明奠定了基礎，同時調節基因和轉運蛋白編碼基因的發現也為井岡霉素產量的提高提供了最理想的改造靶點。另外初步分析顯示，8個必需基因之外的其他結構基因很可能與井岡霉素其他組分的合成相關，因此這些基因功能的闡明有利于消除各種次級組分的積累、顯著提高活性組分井岡霉素A的積累。最近我們在吸水鏈霉菌應城變種1022中克隆和測定了5102I號素的生物合成基因簇。與井岡霉素生物合成基因簇相比，5102I號素的生物合成基因簇中結構基因的排列發生了很大變化，而且也缺少相應的調節基因，這可能是5102I號素產量很低的原因(蹇曉紅等，待發表)。兩個相似抗生素生物合成基因簇的克隆為該類次級代謝產物的比較研究和定向改造提供了良好素材。實現井岡霉素在水稻等植物中的表達、直接抵抗水稻紋枯病等真菌病害的侵染也是本項研究的目標之一，相關工作正在開展,跨學科的合作研究也在醞釀之中。
圖1 井岡霉素/有效霉素的生物合成基因簇（略）
2.2 抗生素FR008/克念菌素的生物合成38元七烯大環內酯類聚酮化合物抗生素FR008是由鏈霉菌FR008產生的，結構上同克念菌素(candicidin)一致，具有抗真菌和殺滅蚊子幼蟲的活性，臨床上多用于念球菌陰道炎的治療，還可通過降低膽固醇，減輕前列腺增生癥。因為抗生素FR008結構中帶有來自于對氨基苯甲酸的對氨基苯乙酮成色基團，所以我們利用來自于克念菌素產生菌灰色鏈霉菌的對氨基苯甲酸合成酶為異源探針，在國際上首次克隆了多烯類聚酮化合物的生物合成基因簇，即抗生素FR008的生物合成基因簇，并通過基因中斷實驗證實該區域跨越150kb以上［17］。最終對總共1498kb區域的序列測定揭示了21個可能的相關基因(圖2)［18］，其中有6個基因編碼巨大的成模塊組織(modular)的聚酮合酶fscAF，共編碼21個模塊，這與抗生素FR008骨架合成所需的21步縮合反應是非常一致的，而且在結構域水平上揭示了七烯共軛結構形成了分子基礎。基因簇序列分析還發現了與起始單位對氨基苯甲酸合成相關的基因(pabAB和pabC)、與海藻糖胺(mycosamine)糖基合成相關的基因(fscMII和fscMIII)、與糖基化和羧化等后修飾反應相關的基因(fscMI、fscP和fscO)。同時還發現了四個調節基因和兩個轉運蛋白，有利于提高抗生素FR008的產量。根據對抗生素FR008生物合成基因簇的生物信息學分析，我們提出了抗生素FR008復合物中四種主要組分的分子轉換模式［18］，近期的研究成果表明這種推斷是正確的，而且獲得了只積累主要活性組分II號組分的工程菌株(周永軍等，待發表)。通過對糖基轉移酶基因的失活獲得了一系列缺失了糖基的新衍生物，并可以初步推斷出糖基的轉移發生在羧化反應之后，是后修飾反應的一步。而對海藻糖胺合成相關的轉氨酶基因fscMII的敲除獲得了糖基上缺少氨基的一系列衍生物，顯示了糖基轉移酶FscMI相對的底物廣譜性。
圖2 抗生素FR008/克念菌素的生物合成基因簇（略）
2.3 南昌霉素的生物合成酸性脂溶性聚醚抗生素南昌霉素由南昌鏈霉菌產生，是鈉離子載體，具有很強的抗雞球蟲病活性，而且安全無毒。產量低是限制南昌霉素推廣使用的主要因素，因此需要克隆其生物合成基因簇，尋找生物合成途徑的限速步驟、調節基因或轉運蛋白基因，通過定向的遺傳改良從根本上提高其產量。由于聚醚骨架的生物合成遵循I型聚酮合酶的催化機制，因此我們利用紅霉素生物合成基因簇的PKS結構域為異源探針在南昌鏈霉菌的基因文庫中釣取了90個陽性克隆，并且經過染色體步移歸為8個獨立的重疊群(contig AH)，暗示該菌株可能編碼至少8個聚酮生物合成基因簇［19］，這與天藍色鏈霉菌［20］和除蟲鏈霉菌［21］的基因組全序列測定揭示的鏈霉菌的基因組復雜性是一致的。進一步的大片段缺失實驗確定了重疊群A負責南昌霉素的生物合成，在此基礎上的1325kb區域的序列測定發現了30個ORF(圖3)［22］， 其中與聚酮鏈合成相關的基因有11個(nanA1A11)，編碼14個模塊74個結構域，而且nanA1A6可能形成一個長達564kb的轉錄單位。很特別的是nan9編碼的模塊13中只含有酮基還原酶KR和酰基轉移酶AT結構域，而缺少酰基載體蛋白ACP結構域，不過下游的nan10則編碼一個獨立的ACP，因此兩者可能是協同作用的。在南昌霉素生物合成基因簇中并沒有發現在其他聚酮生物合成基因簇中負責聚酮鏈釋放的硫酯酶TE結構域或基因，但是初步的生物信息學分析顯示在一個延伸模塊(模塊14)的末端有一個與酯酶同源的結構域CR，很可能通過一種不同的釋放機制來釋放線性的聚酮鏈，相關的研究正在進行之中。聚醚類次級代謝產物在聚酮鏈形成后要經過一系列氧化、異構等級聯反應機制形成聚醚結構，在南昌霉素生物合成基因簇中異構酶NanI、環氧化酶NanO和環氧化物水解酶NanE很可能在聚酮鏈還沒有從聚酮合成酶上釋放之前催化聚醚結構的形成。另外，南昌霉素的生物合成途徑還包括羥化、糖基化過程，相應的羥化酶基因nanP和糖基轉移酶基因nanG5也在基因簇中找到，而且負責糖基4Omethylrhodinose生物合成的所有基因也在基因簇中存在。在南昌霉素生物合成基因簇中存在7個調節基因和2個轉運蛋白編碼基因，暗示南昌霉素的生物合成具有復雜的調控機制，并很可能是導致南昌霉素產量較低的主要原因。對相應調節基因功能的闡明以及在此基礎上的遺傳操作將會成為產量提高的突破口。另外整個基因組中8個聚酮生物合成基因簇的存在也顯示了對共同前體乙酰輔酶A和丙酰輔酶A的競爭，因此其他聚酮生物合成基因簇的敲除應該會導致南昌霉素的產量提高。對重疊群C的缺失的確導致了南昌霉素產量的明顯提高(孫宇暉等，待發表)。
圖3 南昌霉素生物合成基因簇（略）
2.4 梅嶺霉素的生物合成南昌鏈霉菌同時產生梅嶺霉素，它是一種與avermectin骨架結構相似的16元大環內酯抗生素(圖4)，具有甚至比avermectin還要強的抗寄生蟲活性。除了缺少齊墩果糖側鏈外，梅嶺霉素的主要組分還缺少C5位的甲基化，不過梅嶺霉素在C4位上攜帶有3甲基2烯丁酸側鏈。與avermectin結構和生物活性上的異同點為我們定向改造梅嶺霉素或avermectin提供了切入點，如次級組分的消除、依維菌素的直接產生等等。根據avermectin生物合成基因簇的細胞色素P450羥化酶基因aveE、酮基還原酶基因aveF和硫酯酶結構域基因aveTE保守序列設計同源引物，分別在南昌鏈霉菌中擴增出了相應基因片段，測序后發現相互間的核酸同源性分別為706%、659%和757%。利用上述擴增片段為探針進行的雜交初步顯示重疊群H負責梅嶺霉素的生物合成，在該區域的大片段缺失則導致了梅嶺霉素產生能力的徹底喪失［23］。最近完成的該基因簇部分區域的序列測定結構顯示，梅嶺霉素和avermectin在PKS區域的基因排列、模塊組織形式、調節基因等有著高度的相似性，同時也揭示了兩者結構差異的分子基礎，為進一步的定向改造指明了方向(劉天罡等，待發表)。
2.5 其他微生物次級代謝產物生物合成基因的克隆實驗室已經克隆的微生物次級代謝產物生物合成基因簇還有抗腫瘤抗生素口惡唑霉素的生物合成基因簇，它是由白色鏈霉菌產生的一種聚酮多肽復合物，很可能以口惡唑環作為合成的起始單位(圖5)。根據結構推測，口惡唑霉素合成中的未知延伸單位(unknown extender unit)可能來自于甲氧基丙二酸單酰ACP(methoxymalonylACP)。 根據該延伸單位合成基因的保守性設計，設計兼并性引物在白色鏈霉菌中擴增出同源片段，進一步的基因敲除實驗證實該段序列的確參與口惡唑霉素的生物合成(趙春華等，待發表)。利用該段DNA為探針也在白色鏈霉菌基因文庫中釣到了覆蓋135kb區域的陽性克隆，相關的序列測定和功能分析正在進行之中。其他正在克隆的生物合成基因簇有廣譜抗真菌的多抗菌素、抗稻瘟病慶豐霉素、5102II號素等等。
圖4 梅嶺霉素與avermectin的結構比較及avermectin的生物合成基因簇（略）
3 小結
多種微生物次級代謝產物生物合成途徑的克隆、序列測定、基因功能分析和組合生物合成探索，使我們初步構建了微生物次級代謝產物基因工程操作平臺。一方面生物合成途徑和調控機理的闡明為提高次級代謝產物的產量、定向提高活性組分成為可能，另一方面大量基因資源、遺傳操作體系、基因操作原理、產物分離系統的積累與優化，為在研次級代謝產物的進一步結構和活性的組合生物合成改造鋪平了道路。本基因操作平臺的構建也形成了一個開放體系，可以為接納并程序化其他次級代謝產物的研究與創新，并且為其他微生物次級代謝產物研究單位提供經驗和支持。
微生物論文:微生物及其基因呼喚專利法保護
二十一世紀，世界生物技術的發展突飛猛進，隨之也引發了一系列法律上的新問題。分析微生物及其基因是專利法意義上的發明還是科學發現？探討其是否具備專利法保護所應具備的條件，了解發達國家加強生物技術專利保護的國際慣例，對我國的生物技術專利保護具有重要意義。
近年來，生物技術的發展取得了驚人的進步，在農業、醫藥、化工、環保等一系列領域引發了巨大的變革。科學家預言二十一世紀是生物技術的世紀，但是，非技術領域發展的落后使生物技術的先進性未能充分發揮。原先的政治、經濟、醫學、倫理道德、法律制度體系所處的制度環境因為生物技術的發展而發生了重大的改變，而原先建立起來的理論體系、操作系統卻無法像生物技術的發展一樣在短期內迅速實現體系的裂變、轉型、升級。生物技術就像一把雙刃劍，在帶給人們無限驚喜的同時，也帶給了人們無限的苦惱。
在法學界，生物技術及其專利性問題，一直是困擾學者們的重大難題。對于活的生物體及DNA雙螺旋結構的描述主張專利權利，也引發了一系列激烈的爭論，對這個問題的探討已經涉及到了專利制度的本質以及發明和科學發現的界定、科技和倫理等一系列深層次問題。
微生物及其基因專利保護紛爭
根據傳統專利法的觀點，要解決能否就微生物及基因主張專利權利的問題，關鍵在于微生物及基因應屬于專利法上的發明還是科學發現。一般而言，發現是對自然現象本質規律的揭示，而發明則是這些本質規律的具體應用。科學發現雖然可能較之發明對社會的貢獻更大，但其不具備專利法給予專利保護所要求的實用性，不能直接制造出前所未有的產物或直接當作某種方法使用，故不是專利法意義上的發明，不能授予專利權。也就是說，一項重要的科學發現可能會對人類產生深遠的影響，可能會獲得諾貝爾獎，但是卻不會成為專利法上所稱的發明而獲得專利保護。
對微生物及基因的研究成果到底歸屬于發明還是科學發現的不同回答，形成了微生物及基因能否進行專利保護的兩種不同觀點。
一種觀點我們可以稱為否定說，認為微生物及基因是自然界中客觀存在的，人們對其研究的成果恰如門捷列夫根據元素周期的深刻洞悉而繪出的元素周期表，或醫學科研人員憑借對人體的細微研究而畫出的人體解剖圖，當然付出了艱苦卓絕的腦力勞動，但是仍屬于科學發現的范疇，因為科學發現本身就決定了不可能是顯而易見就得出結論的，因此，對于微生物及基因本身，任何人都不可主張專利權利。但是，對其進行提純、凈化、繪制的獨特方法卻屬于專利法的保護范圍，對其可以申請專利。
另一種觀點我們可以稱之為肯定說，認為發明人主張權利的微生物及基因已經因為發明人的提純、凈化、繪制活動而使其改變了原來自然存在的狀態。由于生物科技與社會生活的緊密聯系性，對微生物及基因的研究已不僅僅是對其客觀規律的揭示，它與客觀應用僅有一步之遙。況且，基因研究比較特殊，高風險，高投入，商業應用前景又不可估量，無論是從智慧勞動的角度還是從商業回報的角度，都應該承認其知識產權，授予專利權利，否則會使作為新興產業的生物科技的發展受到很大影響。
筆者認為，在微生物及基因的研究成果的形成過程中，科學發現和發明兩者是兼而有之的，應該對其進行區別對待。
首先，不可否認，微生物及基因是客觀存在于自然界中的，這并不以我們對其認識多少為轉移，首次觀察到他們的存在應該是一種對客觀事物的揭示，是一種科學發現，當然這種發現也不具有專利法保護所要求的工業實用性標準。所以，即使科研人員為此耗費了畢生的精力，也不能因此主張專利權利，這就像科研人員觀察、測算到了某個宇宙天體的客觀存在但卻不能主張專利權利收取專利費用一樣。
其次，如果研究進一步深入，科研人員對微生物及基因進行一系列的分離、提純、凈化，改變它在自然界天然的存在方式和狀態，使其能為人力所控制，并發掘出它為社會所利用的價值，那么我們就沒有理由拒絕為其提供專利法上的保護了。
其實，科學發現和發明在科技研究中是緊密結合的。任何一項科技發明活動，都必須以原來的科學發現為基礎，沒有任何一項發明是憑空產生的，只有熟練掌握該領域的客觀事物和規律，才能談得上發明創新。在生物技術的科研領域中當然也是這樣，只不過由于生物技術研發本身所具有的高度專業性和連續性，微生物及基因的首次發現者和深層研發利用者往往是同一研究主體。這種發展現狀使得發明和科學發現連為一體，互相交織，相互作用，真假難辨。簡單地講，沒有對客觀規律的揭示或微生物、基因的首次發現，就不可能有生物技術的相關發明，但是，僅僅是客觀揭示和首次發現而請求專利法的保護又是不夠的。這其中，科研人員要做的是將兩者結合起來，搞出生物科技發明成果。我們要做的是將兩者分離開來，予以不同的法律態度。
我國生物技術專利法保護的現狀及對策
我國生物技術的專利保護起步晚于國外發達國家，在現行的專利法中沒有生物技術專利保護的法律規定。但在專利法實施細則中，有關于生物材料的樣品提交以及分類保藏的具體要求。審查指南中，也有對如何確定一類微生物是否具備專利保護條件的判斷標準：“未經人類的任何技術處理而存在于自然界的微生物由于屬于科學發現，且不具有工業實用性，所以不授予專利權。只有當微生物經過分離成為純培養物，并且具有特定的工業用途時，微生物本身才是授予專利的主體”。
應該說，我國關于生物技術專利保護的立法是和TRIPS的相關保護思想相一致的，對工作人員在實際操作中是否給予某項生物技術以專利保護提供了法律依據，對于發展我國的生物技術具有積極的現實意義。
我們不難發現，在我國生物技術的法律保護中，再去爭論微生物及基因在發明、科學發現中的歸屬以及是否給予其專利保護的問題已經沒有太大意義。發達國家的生物技術在寬松的法律環境和強大的政府支持下得以迅速發展，作為生物技術發源地的美國，目前已擁有全世界三分之二強的生物技術公司，其中光是大的生物制藥公司就有225家，工業投資350億美元，可以說對生物技術寬松的法律支持已經在為而且會繼續為美國創造巨大的財富。隨著發展中國家和發達國家在生物技術上的差距日益加大，運用生物技術的斷優勢掠奪全球有限的生物技術資源的“生物海盜行為”會越來越多。在發達國家搶灘登陸建立生物技術上的專利壁壘以取代被逐漸拆除的關稅壁壘的時候，發展中國家所能做的不是沉浸于到底要不要保護的學理爭論之中，而是從維護本國利益出發，在科研實力、法律保護上奮起直追，跟上國際知識產權保護的步伐，真正地學會用知識產權的武器維護自己的正當利益，免受他國的“惡意侵害”。無論是從公共健康、商業利益出發，還是從科技進步、社會發展考慮，生物技術的專利保護都勢在必行。
當前，較大限度地利用現有優勢，加快生物技術專利的國際保護進程，在專利的國際申請中，充分利用國際條約中的外國優先權制度，爭取以最快的時間在國際上搶占先機已是當務之急。
1967年修訂的保護工業產權巴黎公約規定：“已在一個本同盟成員國正式提出過一項發明專利、一項實用新型、一項工業品式樣或一項注冊商標的申請人或其他權利繼承人，在下列規定的期限內在其他本同盟成員國提出同樣的申請時享有優先權。”上述優先權期限，對于發明專利和實用新型，規定為12個月，對工業品式樣和商標規定為6個月。簡單地講，就微生物及基因的專利保護而言，在12個月以內，專利申請人在巴黎公約其他締約國提出的專利申請以他在本國首次提出的專利申請日期作為判斷新穎性的時間標準。這種優先權利的取得要以申請人在本國規定的最遲期限內作出聲明作為形式要件。
12個月的時間對于人類社會的發展來說只是短短的一瞬，但是對于發展速度突飛猛進的生物技術來講可能意味著天翻地覆的變化。生物技術的發展正在體現出“強者愈強，弱者愈弱”的態勢。我國如果不能搶得先機，就會受到各種不公平的待遇，發展的成本就會成倍地增長。
