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及時章 反向遺傳學概述

及時節 反向遺傳學產生的背景

反向遺傳學 (eeseeis)是相對于經典遺傳學而言的一門方法學 ,在認識反rvregntc向遺傳學之前 ,首先要了解遺傳學產生與發展的過程 .所謂 "遺傳 ",是指生物通過各種方式保障生命在自然界中延續 ,并使子代與親代保持某些相似特征的現象 .人們很早就開始探討有關親代和雜交子代之間的性狀遺傳規律 ,但一直未取得突破性進展 .直到1866年奧地利學者 Mendel根據他的豌豆雜交實驗結果發表了 .植物雜交試驗 .的論文,提出兩個影響深遠的基本遺傳法則 ,即分離法則 (定律 )(圖1-1)和自由組合法(定律 )(圖1-2),這兩條法則后來被稱為孟德爾定律 ,奠定了現代遺傳學的基礎 (C則ann,2005 ).1909年英國遺傳學家 Bateon提出了 "遺傳學 " (genetics)這一學科名稱,并對其進行了定義 ,認為遺傳學是研究生物的遺傳和變異 ,即研究親子之間異同的生物學分支學科 .其研究范圍包括 :遺傳物質的本質?遺傳物質的傳遞和遺傳信息的實現三個方面 .自此 ,遺傳學正式成為一門學科 .100余年來 ,遺傳學家們都是在圍繞這三個方面進行研究 .

1909年,在 Morgan的領導下 ,一批科學家以果蠅作為遺傳研究的材料 ,在廣泛和深入研究的基礎上 ,提出了第三條經典遺傳規律 ,即連鎖和交換規律 .但此時的基因被認為只是一個交換?重組和突變時無法再分的單位 ,其物理和化學性質?結構等仍然是個謎 .1930~1952年,美國一個噬菌體研究小組經過一系列的實驗 ,最終確定 :DNA是遺傳物質 (趙壽元和喬守怡 ,2001 ).這一階段的遺傳學被稱為經典遺傳學 ,其研究核心是通過研究生物的性狀或表型 ,進而研究遺傳物質的本質及遺傳信息的傳遞規律 .回顧經典遺傳學的發展歷程 ,不難發現早期的遺傳學家都是通過觀察和研究生物表型和性狀的改變來探索生物遺傳的規律 ,解釋遺傳的本質 ,所使用的一些研究方法主要是研究系譜和雜交育種 ,上述一些遺傳規律或法則就是運用這些研究方法得到的.

圖1-1 孟德爾分離定律示意圖孟德爾的分離定律可表述為一對等位基因在雜合狀態 (Aa)下,互不干預 ,保持其獨立性 ,在形成配子時各自 (A或a)分配到不同配子中 .在一般情況下 ,F1代配子分離比為1∶1 ,F2代基因型分離比為1∶2∶1 ,子二代表現型分離比是3∶1?

1953年 Watson和 Crick提出了 DNA的雙螺旋結構模型 (圖1-3),Crick繼而于1958年又提出 "中心法則 ".這些理論不僅讓人們了解到遺傳信息的分子結構 ,也闡明遺傳信息的傳遞途徑 ,從而開創了遺傳學的新紀元 ,也標志著遺傳科學進入一個新階段 ,即分子遺傳學階段 .分子遺傳學是建立在微生物學和經典遺傳學的基礎之上,借助生物大分子的研究來闡明生物的遺傳和變異規律的遺傳學分支學科 .經典遺傳學與分子遺傳學都是遵循 "性狀 →基因"的研究路線 ,從分析生物個體的表型入手 ,研究決定這些表型性狀的基因及其調控序列 .可以說分子遺傳學是遺傳學發展的高級階段 ,經典遺傳學的許多原理已經或正在被分子水平的實驗所驗證,有的得到進一步發展,有的被修正或擯棄,許多經典遺傳學無法解決的問題或無法破譯的奧秘也在不斷被解決或揭示.分子遺傳學的誕生不僅發展了經典遺傳學,也為反向遺傳學的產生奠定了理論基礎.

隨著分子遺傳學的發展,許多以基因為操作對象的實驗方法或技術也在不斷被建立與發展.例如,1967年吳瑞博士建立了及時種 DNA測序方法,即引物延伸測序策略; Smith等 (1970)發現了限制性內切核酸酶在分子遺傳中的作用,為基因工程奠定了基礎;1972年,以 Berg為代表的一批美國科學家發明了人工重組 DNA技術,并得到了及時個重組 DNA分子;1974年,人們首次實現異源真核生物的基因在大腸桿菌中的表達;1975年,美國的 Temin和 Baltimore在 RNA腫瘤病毒中發現了反轉錄酶,它以 RNA為模板,反轉錄生成 DNA,等等 (吳乃虎,2003).如此一系列基因工程技術的建立與發展不僅方便了人們在分子水平上對生物遺傳規律的研究,也為開展反向遺傳學研究提供了技術支撐.

如前文所述,經典遺傳學遵循 "性狀→基因"的研究路線探討遺傳物質的本質及遺傳信息的傳遞規律.但事實證明,要進一步探索生命世界的奧秘,從根本上揭示生命的遺傳規律,僅走這一條研究路線是不夠的.隨著越來越多生物體基因的發現及其序列的測定,人們發現可以直接從基因入手開展遺傳學研究,即采用 "基因→性狀"的研究路線.由于這種研究生物遺傳學的思路是與經典遺傳學研究中所使用的思路逆向而行,所以稱之為反向遺傳學.目前反向遺傳學已經廣泛應用于生命科學研究的各個領域中,如反向疫苗學?轉基因動 (植)物?寄生蟲學以及微生物學等.當今比較流行的 RNA干擾(RNA interference,RNAi)?基因敲除 (gene knockout)?反義 RNA (antisense RNA)?基因過表達 (gene overexpression)?定點誘變 (site-directed mutagenesis)或體外誘變(in vitro mutagenesis)等都屬于反向遺傳學范疇.

第二節 反向遺傳學的概念

廣義的反向遺傳學泛指從生物基因組及其所含生物信息出發,采用 "基因 →性狀"的研究路線,對生物體進行遺傳和變異規律的研究,揭示生物的表現型與基因型之間的關系,探討生命遺傳規律的分子遺傳學分支學科.從方法學角度而言,反向遺傳學是在獲得生物基因信息的基礎上,對基因進行操作,來研究生物基因結構和功能的策略.其所涉及的技術包括:基因的定點突變?基因插入/缺失和基因置換等.目前,反向遺傳學已成為最能有力推動植物學?動物學及微生物學研究的前沿學科之一.

狹義的反向遺傳學僅是指對微生物 (包括細菌和病毒)的反向遺傳操作和研究,尤其是 RNA病毒的反向遺傳學操作.這是由于 RNA病毒的基因組一般比較小,更有利于反向遺傳操作.目前已有許多病毒的反向遺傳學研究系統被建立起來,成功實現了病毒的體外 "拯救".在此基礎上,人們可以很方便地從基因組入手研究病毒的分子特征?致病機理?病毒與宿主之間的相互作用以及開展新型疫苗的研究等工作,從而開創了分子病毒學研究領域的新局面.

第三節 反向遺傳學的原理

由于幾乎所有的基因工程技術都是以 DNA為操作對象,因此 DNA病毒的反向遺傳操作相對容易,許多 DNA病毒的基因組結構與功能?基因的復制與表達機制?分子致病機理等不斷被揭示,其研究領域也因此得到不斷擴展和縱深.相比之下,RNA病毒的分子生物學研究則顯得較為滯后.因為非反轉錄 RNA病毒的復制周期并不經歷 DNA階段,其基因組分別以各自特有的 RNA形式存在于自然界中,RNA的分子結構特征決定了它的不穩定性和易降解性,病毒 RNA一旦脫離病毒核衣殼的保護就難以存在.因此,在體外操作 RNA病毒基因組比較困難.而反向遺傳操作技術的發明改變了這種狀況,通過將病毒 RNA轉換為cDNA,在 DNA分子水平上研究 RNA病毒成為可能,RNA病毒的研究也因此取得巨大進展.

RNA病毒反向遺傳學研究的核心是構建感染性cDNA分子克隆,即在獲得病毒基因組序列的基礎上,借助載體構建病毒的全長cDNA分子克隆,同時將 RNA聚合酶的啟動子元件也導入該分子克隆中,通過體外轉錄過程,合成病毒 RNA,然后用該轉錄物侵染宿主或敏感細胞系,拯救出與母本病毒具有相同特性的活病毒.這種病毒拯救過程是針對正鏈 RNA病毒而言.由于負鏈 RNA病毒裸露的基因組或由其cDNA轉錄而來的 RNA沒有感染性,它們必須與核衣殼蛋白?RNA依賴性 RNA聚合酶等形成核糖核蛋白復合物 (RNP),才能進行正常的復制和病毒粒子的包裝.因此,建立負鏈 RNA病毒的反向遺傳學研究系統,不僅要構建含有病毒全基因組的 cDNA分子克隆,而且要構建一些輔助質粒,其中含有 RNA復制酶及核蛋白的編碼序列,然后將這些重組質粒共同轉染宿主細胞,經過內轉錄過程實現負鏈 RNA病毒的拯救,如 Schnel等 (1994)將含狂犬病病毒 NP?P和L基因的重組表達質粒與含病毒全長反義基因組的質粒共轉染能穩定表達T7 RNA聚合酶的細胞系,在細胞內形成 RNPs,然后在T7RNA聚合酶的作用下進行轉錄和翻譯,并裝配成完整的病毒粒子,實現了狂犬病病毒的拯救 (MertensandDiprose,2004).早期的禽流感病毒的拯救則需要共轉染12個質粒,其中包括能轉錄8個基因片段的8個轉錄質粒,以及表達PB2?PB1?PA和 NP蛋白的4個表達質粒,后來建立起轉錄/翻譯載體后才把質粒數減少到8個.由于這種拯救病毒來自于病毒基因組的cDNA分子,因此,可以在 DNA水平上對病毒基因組進行操作,研究拯救病毒基因型的改變對病毒表型的影響,進而對病毒基因組結構與功能?表達與調控進行研究,甚至還可以研究病毒的致病機制?分子免疫機理等.另外,依賴于反向遺傳學系統,研究者還能設計出一種能輸送治療基因的載體,甚至研制出一種毒力減弱的活病毒疫苗以預防由 RNA病毒引起的許多疾病,這種研究疫苗的方法被稱為反向疫苗學 (reversevac inology)(Sommerfelt,1999).

理論上所有的 RNA病毒都可以通過構建感染性克隆來開展病毒的分子生物學研究,然而,這種研究策略取決于病毒是否有體外增殖系統 (主要是敏感細胞系).因為,所構建的感染性克隆必須首先能在體外培養系統內實現病毒的拯救,然后才能進行反向遺傳操作.事實上,許多 RNA病毒都缺乏敏感細胞系,如丙型肝炎病毒?諾瓦克病毒?兔出血癥病毒 ,等等 .顯然 ,利用感染性克隆技術研究這些病毒的致病機理?遺傳變異和毒力進化等是行不通的 .但是 ,利用反向遺傳學技術在研究這些病毒的基因組復制或表達機制等方面仍具有明顯的技術優勢 ,這就需要引入復制子 (replicon)的概念 .通常復制子是指 DNA中能發生獨立復制的一段 DNA序列 ,在該序列中不僅有復制原點和復制終點 ,而且含有調節 DNA復制的一些順式元件 .在真核生物中 ,DNA的復制是從許多起始點同時開始的 ,所以每個 DNA分子上有許多個復制子 .每個復制子都含有一個復制起點 .原核生物的染色體和質粒?真核生物的細胞器 DNA都是環狀雙鏈分子 ,它們都是單復制子 ,都在一個固定的起點開始復制 ,復制方向大多數是雙向的 ,少數是單向復制 .就 RNA病毒而言 ,復制子是指保留了病毒基因組復制所必需的非結構蛋白編碼基因和非編碼區的順式作用元件的一種缺陷型基因組 ,它能夠在宿主細胞內有效復制 ;但由于缺失了結構蛋白編碼基因 ,因此復制子在細胞內無法形成感染性的病毒顆粒 .圖1-4是黃病毒科昆津病毒復制子的結構示意圖 ,該復制子以外源基因置換了病毒的結構蛋白編碼基因 ,而保留了所有的非結構蛋白和兩側的非編碼區 (5′/3′ UTR),為便于篩選能支持復制子持續性復制的細胞系 ,在非結構蛋白的下游還插入一個抗性基因 .由于抗性基因的表達受控于外加的內部核糖體結合位點元件 (IRES),而外源基因的表達則利用昆津病毒的表達元件來實現 .因此 ,這種復制子又被稱為選擇性 (雙順反子 )復制子系統 .

圖1-4 昆津病毒復制子結構示意圖 (引自 Pjmata.,2006 )

復制子在 RNA病毒研究中應用非常廣泛 ,而且它的應用不受培養系統限制 .因為可以將 RNA病毒復制子構建成重組質粒 ,然后將質粒直接轉染細胞系 ,通過報道基因的瞬時或穩定表達來評價反向遺傳操作對 RNA病毒的復制或表達的影響 .此外 ,復制子系統對研究一些生物安全級別比較高的病毒 ,如口蹄疫病毒?新城疫病毒和禽流感病毒等也提供了一個很方便的操作平臺 ,研究這些病毒的復制和表達調控的分子機理等不需要操作具有感染性的病毒就可以實現 .但復制子在 RNA病毒研究領域中的應用 ,更多地體現在新型病毒 ……