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實驗一DNA的提取

[實驗目的]

了解DNA提取的基本原理，掌握DNA的提取方法？

[實驗原理]

遺傳信息全部儲存在DNA -級結構之中，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質？脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整？

一？分離純化DNA的原則

(l)保持DNA分子一級結構的完整性？溫度不要過高;控制一定的pH范圍(pH5~9)，保持一定的離子強度，減少物理因素對核酸降解的機械剪切力？

(2)防止DNA的生物降解？細胞內或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結構？因此，所用器械和一些試劑需要高溫滅菌，提取緩沖液中也需要加核酸酶抑制劑？

二？分離提取核酸的主要步驟

(一)細胞的破碎

細胞破碎的常用方法有以下幾種？

(l)高速組織搗碎機搗碎;

(2)玻璃勻漿器勻漿;

(3)超聲波處理法;

(4)液氮研磨法;

(5)化學處理法(SDS？Tween-80等);

(6)生化法(溶菌酶？纖維素酶等)？

(二)核蛋白的解聚？變性蛋白的去除

核酸與蛋白質的結合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結合)？氫鍵和非極性的范德華力？分離核酸最困難的是將與核酸緊密結合的蛋白質分開，同時避免核酸降解？

提取DNA的一般過程足將分散好的組織細胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液再經過乙醇沉淀，使DNA從溶液中析出？

蛋白酶K能在SDS和EDTA-2Na存在下保持很高的活性？在勻漿后提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜？核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA-2Na則抑制細胞中DNA酶(DNase)的活性;而蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來？

常見的DNA酶抑制劑如下:

(l)金屬離子螯合劑？DNA酶需要金屬二價離子Mg2+？Cap_的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性？如EDTA-2Na等？

(2)陰離子型表面活性劑？如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質變性，并與變性蛋白結合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中易于沉淀？

常用DNA提取原理如下？

(l)加入10倍體積的緩沖液:10 mmol/L Tris-HCI (pH 7.4)，150 mmol/L NaCI，10 mmol/L EDTA，0.50/ SDS？其中，NaCI破壞核酸一蛋白質間的靜電引力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚;EDTA破壞細胞膜？螯合Ca2_，使DNase失活;SDS可破壞細胞膜？抑制核酸酶，還可使核酸從蛋白質上游離m來？

(2)加入蛋白酶K？蛋白酶K是一種非特異性蛋白酶，它可將蚤白質消化成氨基酸？一般工作濃度是50--100 ug/mL？反應時間大于5h，反應溫度55℃？

(三)核酸的沉淀

沉淀是濃縮核酸最常用的方法？優點:改變核酸的溶解緩沖液;重新調整核酸的濃度;去除溶液中某些鹽離子與雜質？

1.常見的用于DNA沉淀的鹽類及濃度(表1-1)

2.有機沉淀劑

(1)乙醇？優點:對鹽類沉淀少，沉淀中所含少量乙醇易揮發除去？缺點:需要量大(2~3倍體積)？

(2)異丙醇？優點:需體積小，速度快，適于濃度低？體積大的DNA樣品沉淀？一般不需低溫長時間放置？缺點:易使鹽類？蔗糖與DNA共沉淀;異丙醇難以揮發除去？

(3)聚乙二醇(PEG)？優點:可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質量的DN段？應用PEG600進行DNA沉淀時，使用濃度與DN段的大小成反比？注意:PEG沉淀一般需要加入0.5 mol/L的NaCI或10 mmol/L的MgClp;

(4)精胺(spermine)？精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA？原理:精胺與DNA結合后，使DNA在溶液中結構凝縮而發生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質雜質與DNA分開，達到純化DNA的目的？

3.核酸沉淀的溫度和時間

核酸沉淀應該在低溫下長時間進行？若溶液中核酸濃度很高，在鹽離子存在的情況下，加入異丙醇等后即可看到DNA的絮狀沉淀？若溶液中核酸濃度很低，則需在-20℃條件下過夜？酵母tRNA可有助納克(ng)級的核酸沉淀？大于10 ltg/mL的核酸，冰浴10 min即可有效沉淀？

(四)核酸的保存

1.DNA

DNA樣品溶于pH 8.O的TE緩沖液中，4℃或-20℃保存，或者加1滴氯仿-70℃可保存數年？

2.RNA

(l) RNA樣品溶于含0.3 mol/L NaAc (pH 5.2)的2倍體積的乙醇中，-70℃保存？

(2)在RNA溶液中加1滴氯仿或0.2 mol/L VRC(氧釩核糖核苷復合物)凍存于-70℃，可保存數年？

(五)常見基因組DNA提取方法

1.基因組DNA提取-CTAB法(植物DNA提取經典方法)

十六烷基三甲基溴化銨( hexadecVlt rimethvlammoniumbro mide，CTAB)是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物？該復合物在高鹽溶液中(>0.7 mol/LNaCI)是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白質？多糖？酚類等雜質盾加入乙醇沉淀即可使核酸分離m來？CTAB提取緩沖液經典配方及改進配方見表1-2和表1 3？

表1-2CTAB提取緩沖液的經典配方

表1-3CTAB提取緩沖液的改進配方

CTAB洼實驗流程見圖1-1？

2.基因組DNA提取——SDS法

SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫(55--65℃)條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白質變性，釋放出核酸;然后，提高鹽(KAc或NHd Ac)濃度并降低溫度(冰浴)，使蛋白質及多糖雜質沉淀，離心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA？

SDS法適用于大部分實驗材料的基因組DNA提取，如動物組織？細胞？全血？細菌？SDS法實驗流程見圖1-2(以動物組織為例)？

圖1-2SDS法實驗流程

(六)幾種常見細胞或組織DNA的提取

1.細菌基因組DNA的制備過程

(l)細胞裂解？0.6倍體積的異丙醇或2倍體積乙醇(可以加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨輔助沉淀)？

(2)DNA純化？CTAB除去多糖，酚氯仿一異戊醇除去蛋白質？

(3)沉淀DNA？10% SDS和蛋白酶K？

2.哺乳動物細胞基因組DNA的抽提過程

(l)組織粉碎？動物組織剪成小塊，置液氮中凍結后研磨成細粉末;組織培養的細胞用胰酶消化松散后直接使用？

(2)細胞裂解？0.5% SDS和0.1 mg/mL蛋白酶K，50℃溫育？

(3)沉淀DNA？用2倍體積的無水乙醇或0.6倍體積的異丙醇(加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨可以輔助沉淀)？

3.從植物組織中制備DNA

(l)組織粉碎？用液氮冷凍后研磨成細粉末？

(2)細胞裂解？用20/ CTAB/13-ME(十六烷基三甲基溴化銨/p巰基乙醇)或l%SDS和蛋白酶K，65℃溫育？

(3)沉淀DNA:用0.6倍體積的異丙醇(-20℃)(可以加入1/10體積的3 mol/L乙酸銨輔助沉淀)？

[實驗用品]

1.材料

動物組織？

2.器材和儀器

(1)恒溫水浴鍋？

(2)臺式離心機？

(3)紫外分光光度計？

(4)移液器？

(5)玻璃勻漿器？

(6)離心管(滅菌)？

(7)吸頭(滅菌)等？

3.試劑

(l)細胞裂解緩沖液？

Tris(pH 8.O)100 mmol/L EDTA (pH 8.O)500 mmol/L

NaCI20 mmol/L

SDS100

胰RNA酶20 ltg/mL

(2)蛋白酶K？稱取20mg蛋白酶K溶于1mL滅菌的雙蒸水中，-20℃備用？

(3)TE緩沖液(pH 8.O)？高壓滅菌，室溫保存？

(4)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)？

(5)異丙醇？

(6)預冷無水乙醇？

(7)70g乙醇？

(8)滅菌水？

(9)TIANamp Genomic DNA kit (DP304)斌劑盒？

[實驗內容]

1.方法一

(l)取新鮮或冰凍動物組織塊0.19(0.5 cm:i)，盡量剪碎？置于研缽研碎，加入1 mL的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5mL離心管中，加入蛋白酶K(500 ljg/mL)20 ljL，混勻？在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min(也可轉入37℃水浴12~24 h)，間歇振蕩離心管數次？在臺式離心機上，以12000g離心5min，取上清液人另一離心管中？

(2)加2倍體積異丙醇，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100 LiL吸頭挑出，晾干，用200 ljL TE重新溶解(可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行)？

(3)加等量的酚/氯仿/異戊醇振蕩混勻，12000g離心5 min？

(4)取上層溶液至另一管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，12000g離心，5min？

(5)取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5 mol/L乙酸銨和2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2 min，12000g離心10min？

(6)小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉？

(7)用1 mL 70%乙醇洗滌沉淀物1次，12000 9離心5 min？

(8)小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥？

(9)加200 UL TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存備用？

(10)吸取適量樣品于紫外分光光度計上檢測濃度和純度？

2.方法二

使用TIANamp Genomic DNA kit (DP 304)誠劑盒提取DNA？

(l)動物組織(小于10mg)用液氮研磨后，加入200 FiL緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮？

(2)加入20uL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，混勻，56℃放置，直到組織溶解？

(3)加入200uL緩沖液GB，充分顛倒混合，70℃放置10min，直到溶液變清亮？

(4)加入200uL無水乙醇，充分振蕩混合15s？

(5)將所有溶液及絮狀沉淀加入到吸附柱CB 3中(吸附柱放人收集管中)，12 000g離心30s，棄濾液，將吸附柱放回收集管中？

(6)向吸附柱中加入500uL緩沖液GD，12000g離心30s，棄濾液，將吸附柱放回到收集管中？

(7)向吸附柱中加入700uL漂洗液PW，12000g離心30s，棄濾液，將吸附柱放回到收集管中？

(8)向吸附柱中加入500uL漂洗液PW，12000g離心30s，棄濾液，將吸附柱放回到收集管中？

(9)將吸附柱放回收集管中，12 000g離心2min;

(10)將吸附柱放到一個干凈離心管中，加入 TE緩沖液，室溫放置3min，離心2min，收集到的溶液即為DNA溶液？

[注意事項]

(l)選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不要過長？

(2)在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少DNA團塊形成？

(3)提取的DNA不易溶解，可能的原因:DNA不純，含雜質較多;加溶解液太少使濃度過大;沉淀物太干燥，也會使溶解變得很困難？

(4)電泳檢測時DNA成涂布狀，可能的原因:操作不慎;污染核酸酶等？

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