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第1章概論

1.1色譜分析法的歷史為了弄清楚混合物中的各組分是何種物質及含量是多少，可以采用的方法之一是先將各組分分離，然后對已分離的組分進行測定，色譜分析法就屬于這種方法。色譜分析法的原理可以簡述為： 被分離的各組分是在兩相之間反復進行分配的，其中一相靜止不動，稱為固定相，另一相是攜帶被分離組分流過固定相的流體，稱為流動相。被分離組分與流動相和固定相都可能發生作用，但被分離的各組分的結構和性質不同，決定了它們與流動相和固定相之間的作用力也不同，導致各組分在固定相與流動相之間的分配系數有差異，經過反復多次的分配，隨流動相向前移動，各組分運動的速度不同，彼此分離。雖然關于色譜法的創立與起源在說法上略有不一，但人們基本上認為俄國植物學家茨維特(M.S.Tswett)是色譜法的創始人。因為他從1901年起研究用所謂“色譜法”分離、提純植物色素。他在1903年3月21日于華沙自然科學學會生物學會會議上，提出題目為《一種新型吸附現象及其在生化分析上的應用》論文，敘述了應用吸附劑分離植物色素的新方法。他將葉綠素的石油醚抽提液倒入裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃柱管上端，然后用石油醚進行淋洗，結果不同色素按吸附順序在管內形成相應的彩色環帶，就像光譜一樣。他在1906年發表的另一篇文章中，命名這些色帶為色譜圖，稱此方法為色譜法； 在1907年于德國生物學會會議上，展示過有色帶的柱管和提純的植物色素溶液。英國人馬丁(A.J.P.Martin)與辛格(R.L.M.Synge)在1941年首次提出液液色譜法，使用裝在粗柱管中的粗粒度填料，流動相種類少且只在重力的作用下流過固定相，又沒有高性能的檢測器，因此柱效及檢測靈敏度均較低。液液色譜法在此后較長的一段時間內無顯著改善，即現在所說的經典液相色譜法。1952年馬丁與辛格又研究了在惰性載體表面上涂漬一層均勻的有機化合物液膜，以此作固定相，并以氣體作流動相，創立了氣相色譜法中應用極為廣泛的氣液色譜法。馬丁首次應用該方法成功地分離了脂肪酸混合物。1956年馬丁提出使用小口徑(0.2mm)色譜柱的建議。1957年美國學者Golay首先應用小口徑毛細管進行色譜分離試驗，獲得了高于填充柱的分辨率和柱效能，并從理論上加以初步論述。1959年Porath和Flodin提出了具有化學惰性的多孔凝膠作為固定相的空間排阻色譜法，根據固定相孔隙尺寸的不同而具有不同的選擇性滲透能力，對分子質量及分子尺寸不同的組分具有選擇性，適合測定聚合物的分子質量分布。1970年以后逐漸發展了高效液相色譜法以及各種模式、多種高性能的檢測器和聯用手段，使液相色譜技術逐步產生了實質性的改進和極為廣泛的應用。1975年H.Small及其合作者發表了及時篇離子色譜論文，同年商品儀器問世。初期，離子色譜主要是用于陰離子的分析，目前已經成為在無機和有機陰、陽離子混合物分析中起重要作用的分析技術。1979年彈性石英毛細管色譜柱商品化，使氣相色譜的應用再次發生了飛躍。雖然毛細管電泳以及后來發展的各種模式的相關技術可以上溯到20世紀60年代甚至50年代，但是迅速發展還是在80年代。1981年，Jorgenson和Lukacs使用75μm直徑的熔融石英毛細管做CZE(毛細管區帶電泳)，利用電遷移進樣和熒光檢測，在30kV的電壓下獲得了4×105塔板/m的柱效，成為毛細管電泳發展史上的里程碑。之后發展了膠束電動色譜、毛細管凝膠色譜、毛細管電色譜等模式。主要應用領域是蛋白質分離、糖分析、DNA測序、手性分離、單細胞分析等。我國色譜研究工作起步于1954年，由中國科學院大連化學物理研究所做出首張色譜圖，并進行了早期的色譜理論和技術研究工作。半個世紀以來，全國范圍內的多家高校、科研院所、儀器廠商等單位相繼開展了眾多的色譜法研究和應用工作。近年來，國際性、全國性、省級及區域性的各種色譜學術會議頻繁舉行，我國色譜工作者在色譜的基礎理論和應用研究方面已經取得一些接近國際先進水平的成果，在儀器制造方面近年來積極引進、學習和吸收國外的先進技術，亦取得了顯著的成就。1.2色譜法的分類色譜法有多種類型，從不同角度出發，有各種色譜分類法。1.2.1按流動相和固定相的物態分類按流動相的狀態，色譜法可分為氣相色譜法(gas chromatography,GC,流動相為氣體)、液相色譜法(liquid chromatography,LC,流動相為液體)和超臨界流體色譜法； 按固定相的狀態，又可分為氣固色譜法、氣液色譜法、液固色譜法和液液色譜法等，見表11。

表11按流動相和固定相的物態分類的色譜法

種類流動相固定相固體液體

氣相色譜法氣體氣固吸附色譜法氣液分配色譜法液相色譜法液體液固吸附色譜法液液分配色譜法超臨界流體色譜法超臨界流體

固定相為固體吸附劑，流動相為氣體時，稱為氣固吸附色譜法。固定相是液體，而流動相是氣體時，稱為氣液分配色譜。這時，該液體固定相附著在一種惰性的擔體上(如硅藻土、玻璃微球等)，裝填到色譜柱中，起分配作用的是這層液體，因此這種色譜法叫氣液色譜。超臨界流體色譜技術采用了近乎臨界狀態的稠密氣體為流動相。這種狀態下，流動相對多種物質具有良好的溶解性，因此許多在氣相色譜過程中不穩定的化合物，以及在液相色譜上難以分離的化合物可以采用超臨界流體色譜技術分析。這種技術介乎液相色譜和氣相色譜之間，但不能取代其他種類的色譜技術。1.2.2按分離的原理分類利用組分在流動相和固定相之間的分離原理不同來分類，可以將色譜法分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、凝膠滲透色譜法、離子色譜法等10余種方法。吸附色譜法是利用吸附劑對樣品的吸附性能不同達到分離的。它可分為氣固吸附色譜和液固吸附色譜。吸附劑是利用表面的性質來吸附化合物的，表面積越大的吸附劑，吸附能力越強。分配色譜法的分離原理是試樣組分在固定相和流動相之間的溶解度存在差異，因而溶質在兩相間進行分配。離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。凝膠滲透(體積排阻)色譜法，以凝膠為固定相。它的分離機理與其他色譜法不同。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來分離，而是按分子大小進行分離。1.2.3按固定相使用的方式分類根據固定相在色譜分離系統中使用的方式，可分為柱色譜法、紙色譜法和薄層色譜法。柱色譜是指將固定相放在玻璃、不銹鋼、石英等管中，該管子叫做色譜柱，這種色譜法叫柱色譜。如果固定相是用一張紙，并在上面涂以固定液。一般就是在紙上吸上水，成為紙上的固定液。當然要有一定的處理方法，利用紙上吸的水，再用另一種溶劑作沖洗劑。這種方法就叫做紙上層析，也叫紙色譜。將固定相均勻地涂在玻璃或其他材料的平板上，形成一個固定相的薄層，用來進行色譜分離，稱為薄層色譜。1.2.4按色譜動力學過程分類根據流動相洗脫的動力學過程不同，可分為沖洗色譜法、頂替色譜法和迎頭色譜法等。目前，色譜分析中主要用的是沖洗法，頂替法和迎頭法雖然還在用，但是用得很少。沖洗法就是把樣品加在固定相上，然后用流動相沖洗。根據吸附能力和分配系數的不同，按次序洗脫出來。分配系數最小的先出來。沖洗劑，或者是氣體，或者是液體，是不斷加上去的。這是一種最簡單的方法。還有一種方法，就是把樣品加到固定相上以后，例如把烷烴、烯烴和芳烴的混合樣品加到硅膠上，再加入甲醇。由于甲醇的吸附能力較強，它一進去后就在所有的過程中把其他東西往下頂，但是由于芳烴的吸附能力比烯烴強，烯烴的吸附能力又比烷烴強，因此，甲醇首先頂的是芳烴，芳烴下來又頂烯烴。所以經過一段時間以后，流出的次序是： 烷烴走在最前面，烯烴走在中間，芳烴走在，再后面就是甲醇。這就是頂替法。如果不加頂替劑，而是讓樣品連續地通過色譜柱，首先出來的還是烷烴。因為在柱子所吸附的樣品中，烷烴的吸附能力最小，最容易飽和，因此烷烴先出來，接著就是烯烴。因為是連續進樣，所以第二個出來的是烷烴和烯烴的混合物，而不是純烯烴。同樣，出來的是烷烴、烯烴和芳烴的混合物，而不是純芳烴。這就像波浪一樣迎頭而來，所以叫做迎頭法。頂替法和迎頭法在氣相色譜中現在用得很少，但在生化樣品的制備色譜中，仍用得較多。1.2.5按色譜技術分類為提高組分的分離效能和選擇性，采取了許多技術措施，根據這些色譜技術的性質不同而形成了多種色譜種類，包括程序升溫氣相色譜法、反應氣相色譜法、裂解氣相色譜法、頂空氣相色譜法、毛細管氣相色譜法、多維氣相色譜法、制備色譜法7種方法。程序升溫氣相色譜法，是沸點范圍較寬的試樣適宜采用的一種方法。即柱溫按預定的加熱速度，隨時間線性或非線性地增加。升溫的速度一般呈線性，即單位時間內上升的溫度是恒定的，例如2℃/min，4℃/min，6℃/min等。在較低的初始溫度，沸點較低的組分，即最早流出的峰可以得到良好的分離。隨柱溫增加，較高沸點的組分也能較快地流出，并和低沸點組分一樣也能得到分離良好的尖峰。反應氣相色譜法是利用適當的化學反應將難揮發試樣轉化為易揮發的物質，然后以氣相色譜法分析。這樣使那些原本不適用于氣相色譜分析的物質也能進行色譜分析，擴大了色譜法的應用范圍。裂解氣相色譜法是將分子質量較大的物質在高溫下裂解后進行分離檢定，已應用于聚合物的分析。同樣，使色譜法的應用范圍得以延伸。頂空氣相色譜法，嚴格來講，是一種進樣技術。即不直接將樣品進入色譜柱，而是將固體或液體樣品置于密閉的容器中，在一定的溫度下，使氣、固或氣、液兩相達到平衡，然后吸取上端的氣體進樣，通過平衡氣體的分析結果來確定實際樣品的組成和含量的分析方法。毛細管氣相色譜法是采用高分辨能力的毛細管色譜柱來代替填充柱分離復雜組分的色譜法。雖然毛細管柱每米理論塔板數與填充柱相近，但可以使用50～100m的柱子，而柱壓降只相當于4m長的填充柱，總理論塔板數可達10萬～30萬。毛細管柱氣相色譜法是一種高效、快速、高靈敏的分離分析方法。多維氣相色譜法，指在使用多柱或多檢測器的基礎上，還要使用多通閥或通過改變串聯雙柱前后壓力的辦法來改變載氣在柱內的流向。也就是說，樣品可在經過及時次分離后，又通過改變載氣流向的辦法，使樣品全部或部分經過第二柱進行第二次分離或部分從及時柱前反吹出去，從而大大提高了色譜的分離能力。這樣，經及時根色譜柱沒有得到分離的樣品，可通過改變載氣流向的辦法，使樣品進入第二根色譜柱重新進行分離，以得到比單柱系統更多的分離信息。制備色譜法是以色譜技術來分離、制備較大量純組分的有效方法。在現代科學研究工作中，經常期望采用有效方法獲得需要的較高純度的標準物(色譜純)，制備色譜法提供了這種可能。1.3色譜分析法的特點與局限性1. 色譜法的特點

1) 選擇性好 通過選擇對組分有不同作用力的液體、固體作為固定相，在適當的操作溫度下，使組分的分配系數有較大差異，從而將物理、化學性質相近的組分分離開，如恒沸混合物、沸點相近的物質、同位素、空間異構體、同分異構體、旋光異構體等。2) 分離效率高，分析速度快 對于氣相色譜，由于氣體黏度小，用其作為流動相時樣品組分在兩相之間可很快進行分配； 并且通過盛有固定相管柱的阻力小，即可用較長的色譜柱，使分配系數相差很小的組分，可在較短時間內分離開。對于高效液相色譜，液體流動相在高壓泵驅動下能夠快速通過粒度非常細的填料，高效并且快速。3) 靈敏度高、樣品用量少 使用高靈敏度檢測器，可以完成痕量樣品的檢測。如用熱導池檢測器可檢出微克級的組分； 氫火焰離子化檢測器可檢測出百萬分之幾的雜質； 電子俘獲檢測器與火焰光度檢測器可檢測出十億分之幾的雜質。4) 應用范圍廣 氣相色譜在柱溫度條件下，可分析有一定蒸氣壓且熱穩定性好的樣品，可直接進樣分析氣體和易于揮發的有機物； 對于不易揮發或易分解的物質，可轉化成易揮發和熱穩定性好的衍生物進行分析； 部分物質可采取熱裂解的辦法，分析裂解后的產物。高效液相色譜結合多種檢測器可直接分析不易揮發或易分解的物質，高沸點物質、高分子或大分子化合物、部分糖類物質，尤其是在藥物分析方面應用極為廣泛。現在色譜法在分析方面應用的領域主要有石油工業、環境保護、臨床化學、藥物與藥劑、農藥、食品、衛生防疫理化檢驗、司法檢驗等。2. 色譜法的局限性1) 色譜法本身不能夠直接給出定性結果，需要用已知標準物質或將數據與標準數據對比，或與其他方法，如質譜(mass spectrometry,MS)、紅外光譜等聯用才能獲得較的結果。2) 定量測定時需要用標準物質對檢測器信號進行修正。3) 對某些異構體、某些固體物質的分析能力較差。1.4色譜圖和相關術語1. 色譜圖